将焦点转向组织中的细胞以便RNA讲述它们的故事

在显微镜下，研究人员经常观察到不同的细胞类型在组织内以特殊的模式组织起来，或者有时是一种罕见的细胞类型，它们通过占据独特的位置、表现出不寻常的形状或表达特定的生物标志物分子而脱颖而出。

为了确定他们观察的更深层次的意义，他们开发了通过分析细胞内存在的基因衍生RNA分子来访问细胞基因表达模式(转录组)的方法，它们可以与细胞的形状、空间位置和分子相匹配。生物标志物。

然而，这些“空间转录组学”方法仍然只能捕获细胞总RNA分子的一小部分，并且无法提供单细胞测序方法提供的分析深度和质量，而单细胞测序方法是为研究从组织中分离的单个细胞的转录组而开发的或生物流体通过下一代测序(NGS)技术。

它们也不允许研究人员仅根据它们在组织中的位置来定位特定细胞，这将极大地促进对脱节的细胞群或稀有、难以分离的细胞(如具有独特功能的稀有脑细胞或免疫细胞)的研究。侵入肿瘤的细胞。此外，由于原始组织环境被破坏，许多空间转录组学和所有单细胞测序方法都阻止研究人员重新访问他们的样本进行后续分析，并且由于需要专门的仪器或试剂而成本高昂。

哈佛大学威斯生物启发工程研究所取得的一项新进展现在通过一种名为“Light-Seq”的DNA纳米技术驱动方法克服了这些限制。Light-Seq允许研究人员使用少数感兴趣的细胞独有的独特DNA条形码对全部RNA序列进行“地理标记”。这些靶细胞是在显微镜下通过快速有效的光交联过程选择的。

在新的DNA纳米技术的帮助下，条形码RNA序列随后被翻译成连贯的DNA链，然后可以从组织样本中收集并使用NGS进行识别。Light-Seq过程可以针对同一样本中的不同细胞群使用不同的条形码重复，这些条形码保持完整以供后续分析。

凭借与单细胞测序方法相当的性能，它显着拓宽了对组织样本进行研究的深度和范围。该方法发表在NatureMethods上。

“Light-Seq独特的功能组合满足了一个未满足的需求：能够对保存的组织中难以分离的细胞群或稀有细胞类型进行成像知情、空间规定的深度测序分析，其中一个高度精细的基因表达状态与空间、形态和潜在的疾病相关特征一一对应，”PengYin博士说，他是四位通讯作者之一，也是Wyss研究所的核心教员，其中他的团队开发了Light-Seq。

“因此，它有可能加快各种生物医学研究领域的生物发现过程。”尹也是哈佛医学院(HMS)的系统生物学教授。

从原位条形码到异位测序

Light-Seq项目由Jocelyn(Josie)Kishi博士、SinemSaka博士和NinningLiu博士牵头。在Wyss的Yin小组和EmmaWest博士。在HMS的ConstanceCepko实验室。此前，Kishi和Saka开发了SABER-FISH作为空间转录组学方法，用于直接在完整组织中(原位)对基因表达进行成像。

“使用SABRE-FISH，我们距离捕获细胞的完整基因表达程序还有几个数量级，每个细胞有数千个不同的RNA分子。RNA分子过于密集，无法使用目前的成像技术完整捕获，”共同第一和共同通讯作者岸说。

“Light-Seq通过将高分辨率条形码标记与通过NGS的全转录组测序相结合解决了这个问题，为我们提供了两全其美的优势和额外的关键优势。”在研究期间，Kishi是Yin团队的Wyss技术开发研究员，现在正在与她的一些合著者一起寻求将Light-Seq商业化的道路。

“为了在完整组织样本的定制选择位置对细胞进行特异性测序，我们开发了一种将DNA条形码与RNA分子副本光交联的新方法，以及一种由DNA纳米技术驱动的程序，使它们及其附着的RNA序列可以被NGS读取，”共同第一作者、尹氏课题组博士后研究员刘说，他之前共同开发了一种并行化的DNA条形码平台，用于一种称为“Action-PAINT”的超分辨率成像方法，该方法也成为Light-Seq的核心组件之一。

首先，DNA引物与细胞中的RNA分子“碱基配对”，并延伸以创建称为互补DNA序列(cDNA)的RNA序列的副本。然后，含有超快光交联剂核苷酸的DNA条形码链依次与细胞中的cDNA碱基配对。

当目标细胞在显微镜下通过类似模板的光学装置点亮时，这些细胞会永久连接在一起，该装置将显微镜视野中的其他非目标细胞保持在黑暗中，从而使它们免于光交联反应。在将未原位永久连接的细胞中的条形码DNA序列清洗掉后，可以使用不同的条形码和光模式重复该过程，以标记更多感兴趣的区域。

“为了能够将这种条形码工作流程与NGS相结合，我们设计了一种基于DNA纳米技术的新拼接反应。这项创新使我们能够将我们的条形码cDNA转换为连续的读出序列。然后我们可以提取带有条形码的完整集合来自样本的cDNA序列，并使用标准的NGS技术对其进行分析，”该研究的通讯作者之一、目前是德国海德堡欧洲分子生物学实验室的组长Saka解释说。

“最终，每个条形码都将完整的转录组读数追溯到组织样本中预先选择的细胞，这些细胞在后续分析中保持完整。这为我们提供了在测序后重新访问完全相同的细胞以进行验证或进一步探索的独特机会。”

观察复杂组织和稀有细胞

在培养细胞中首次验证Light-Seq之后，Yin的团队希望将其应用于复杂的组织，并与ConstanceCepko博士团队合作。在HMS。Cepko是该研究的通讯作者之一，也是HMSBlavatnik研究所的Bullard遗传学和神经科学教授，研究视网膜作为神经系统模型的发育。

Kishi、Saka和Liu与Cepko小组的West联手，将Light-Seq应用于小鼠视网膜的横截面，并描绘出具有不同功能的三个主要层。研究人员达到了与单细胞测序方法相当的序列覆盖率，并发现在视网膜的三个主要层之间富集了数千个RNA。他们还表明，在序列提取后，组织样本保持完整，可以进一步对蛋白质和其他生物分子进行成像。

“将Light-Seq发挥到极致，我们能够分离出一种非常罕见的细胞类型的完整转录组，这种细胞类型被称为‘多巴胺能无长突细胞’(DAC)，由于它与体内其他细胞的复杂联系，因此极难分离。视网膜，通过每个横截面仅检索四到八个单独的条形码细胞，”韦斯特说。DAC通过在昼夜循环中微调对不同光照暴露的视觉感知，参与调节眼睛的昼夜节律。

“Light-Seq还提取了在DAC中以低水平特异性表达的RNA，以及据我们所知以前从未描述过的数十种DAC特异性生物标志物RNA，这为研究这种稀有细胞类型开辟了新的机会”West补充说，他在研究期间是一名研究生，然后是Cepko的博士后研究员，现在已经加入了Kishi的Light-Seq商业化工作。

向NGS开放空间转录组学领域还增加了有关单个RNA物种水平的信息。“我们的测序数据清楚地表明Light-Seq可以确定RNA结构的自然变异。展望未来，我们非常有兴趣使用Light-Seq更好地了解免疫系统、疾病传播细胞和不同细胞之间的相互作用。基因和细胞疗法等治疗策略，”岸说。

“Wyss研究所分子机器人计划中PengYin小组开发的Light-Seq技术再次表明，追求一种完全非传统的方法和利用合成生物学可以带来一种颠覆性技术，在推进基础研究和临床医学方面具有巨大潜力，”Wyss创始董事DonaldIngber医学博士说，他也是哈佛医学院和波士顿儿童医院的JudahFolkman血管生物学教授，以及哈佛约翰·A·保尔森学院的HansjörgWyss仿生工程教授工程和应用科学。