研究人员以3D方式制造大脑皮层组织并将它们功能性地整合到小鼠的脑部病变中

在最近发布到bioRxiv*预印本服务器的一项研究中，研究人员制作了三个维度(3D)的大脑皮层组织，并将它们在功能上整合到小鼠的脑部病变中。

具有所需细胞功能和结构的细胞多样化人体组织的组织工程具有挑战性。大脑皮层组织的结构是分层的，特定层的神经元排列在垂直方向的列中，通过复杂的神经回路传递高认知。涉及植入脑类器官和神经祖细胞(NP)细胞的方法在完全恢复受损颅骨组织方面的成功有限，因为植入的细胞无法提供类似于人类大脑的细胞解剖结构。

关于研究

在本研究中，研究人员通过基于液滴和压电的3D打印制造了分层的大脑皮层组织，并将这些组织在功能上整合到小鼠的脑损伤中。

人类诱导的多能干细胞(hiPSC)被分化为上层NPs(UNPs)和深层NPs(DNPs)，随后使用基于液滴的打印方法打印形成大脑皮层的两层组织。该技术产生了不含支架且结构明确的软组织，包括细胞和ECM(细胞外基质)。

3D打印的细胞经历了几个成熟过程，例如终末分化、过程生长和细胞迁移。随后将它们植入小鼠脑损伤外植体中，以监测细胞结构的整合7天。层特异性神经元细胞、红色荧光蛋白(RFP)标记的UNP和未标记的DNP被打印形成16x8x8双层DRN(液滴网络)，宽度和高度分别为500μm和1000μm，被打印层-逐层生成亚毫米级立方结构和不同形状的厘米级结构。

hiPSCs由健康个体的多能体细胞重新编程并进行免疫染色。NIM(神经诱导培养基)含有SMAD(母亲对decapentaplegic的抑制剂)抑制剂SB431542和LDN193189，用于将hiPSC细胞诱导为神经外胚层细胞，随后在NMM(神经维持培养基)中培养，以使NP在体外产生。

通过播种NP和使用含有γ-分泌酶抑制剂(DAPT)的NTM(神经末端培养基)使细胞成熟。与Boissart的方案相似，NPs用生长因子的混合物处理，例如EGF、FGF-2和BDNF。此外，还进行了RT-qPCR(实时定量聚合酶链反应)基因表达分析，以确认UN和DN细胞的身份。

同时打印两个8x8x8DRN(一个包含UNP，另一个包含DNP)以产生16x8x8DRN。宿主和植入物之间的整合是根据过程向外生长的程度和神经元从植入部位向宿主迁移的程度来评估的。基于Ca2+成像分析使用Fluo-4评估植入组织功能，并记录植入物/外植体界面处的钙离子信号以评估宿主和植入物之间的钙振荡相关性。

结果

类似于人类大脑皮层结构的六层皮层结构可以通过基于液滴的3D打印产生。在打印后的组织培养过程中，NP细胞在打印的组织中分化。有趣的是，UNP和DNP在宿主中继续成熟，尽管它们存在于共同的生长培养基中。包含不同神经元类型而无需基因操作的组织生产降低了安全问题，并可应用于细胞多样化的组织构建。

液滴打印的3D植入物可以设计为具有与受伤/丢失组织相似的方向、尺寸、结构和成分，其中100μm直径的液滴包含细胞和ECM。将印刷和分层的大脑皮层组织植入小鼠大脑外植体显示出基于植入物到宿主过程生长的结构整合和基于宿主-植入物相关Ca2+振荡的神经元迁移和功能整合。

NPs主要分化为表达CTIP2深层生物标志物的深层神经元(DN)。免疫染色细胞显示NANOG、OCT4(八聚体结合转录因子4)和TRA-1-60(T细胞受体α基因座)多能性标志物表达升高。上神经元(UN)在形态上类似于深层神经元(DN);然而，观察到BRN2和类切割同源框(CUX)1、2等上层标记的表达升高，以及中层SATB2(特殊的富含AT序列结合蛋白2)标记的表达升高。

与hiPSCs相比，生长因子鸡尾酒处理分别显着增强了UNPs和UNs中CUX1的表达20倍和22倍。DNPs中配对盒蛋白(PAX6)神经干细胞标志物表达升高，表明皮层神经元的成功诱导。在细胞中观察到NESTIN(神经上皮干细胞蛋白)、TUJ1(III类-β微管蛋白)和SOX2(性别决定区Y-box2)表达升高，表明它们是神经性的。在皮质层细胞中观察到升高的HNCAM(人神经细胞粘附分子)神经标志物表达，表明人源神经元。

结论

总体而言，研究结果表明，三维打印技术可用于生产具有简化的双层大脑皮质柱的组织。打印后在体外保留了上层和深层的结构和特性，并观察了成熟细胞从植入物到宿主的过程生长和神经元迁移。将3D打印的皮质组织植入小鼠脑组织外植体中显示了植入物与宿主的功能和结构整合。