在蛋白质翻译过程中捕获瞬间的新方法

新生的多肽链或息肽基-tRNA(pep-tRNA)在蛋白质合成过程中短暂发生。研究这些中间体并更好地了解它们在基因调控等过程中的作用的潜力通过开发一种称为PETEOS的过程而大大增强，PETEOS是使用有机提取和二氧化硅吸附的肽基-tRNA富集的缩写。这种方法由东京工业大学的科学家开发，可以大规模收获，加工和鉴定pep-tRNA多肽部分。

分子生物学的进步表明，pep-tRNA(核糖体内与转移RNA共价连接的新生多肽)参与无数细胞功能，包括基因表达。所有蛋白质在某个时候都以pep-tRNA的形式存在，研究这些翻译中间体至关重要，因为它们具有RNA和蛋白质的特性，可以帮助研究人员更好地了解翻译的细节。根据刺激和/或应力，平移调节非常迅速，跨越起始、伸长和伸长暂停。因此，要更深入地了解翻译过程，需要一种合适的方法来大量处理pep-tRNA。这些细微差别推动了研究细胞翻译的分子工具的发展。

目前，用于研究细胞翻译的两种主要方法利用了截然不同的策略。第一种是核糖体分析，这是一种强大的深度测序技术，通过靶向RNase消化产生的核糖体保护的mRNA片段来监测翻译。不幸的是，这种方法本质上无法捕获pep-tRNA，耗时，昂贵且数据密集。替代方案依赖于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的蛋白质组学，并且需要使用不寻常的氨基酸来标记多肽。然而，这种蛋白质组学方法是时间密集型的，最重要的是，不能捕获细胞的翻译伸长状态，因为pep-tRNA不是直接靶标。

为了绕过“pep-tRNA-ome”技术的这些局限性，由HidekiTaguchi教授领导的东京工业大学(TokyoTech)的科学家团队开发了PETEOS。他们的研究结果现已发表在《核酸研究》上。关于他们工作的主要优势，田口教授解释说：“这种非标记方法的独特之处在于它专门丰富和快速捕获pep-tRNA，同时仍然补充了传统的翻译组分析平台。

PETEOS有四个步骤。首先，使用有机溶剂萃取富集RNA，然后在硅胶柱上分离。接下来，使用高pH和温度的组合将分离的pep-tRNA中的靶多肽与其核糖核苷酸分离。然后，将释放的多肽进行酶消化和裂解。最后，使用枪式LC-MS/MS蛋白质组学鉴定这些多肽。“作为概念验证，我们能够使用PETEOS鉴定出近800种来自pep-tRNA的大肠杆菌蛋白。重要的是，这些蛋白质富含N末端，这强调了该方法确实在翻译过程中捕获了中间的pep-tRNA库。“，田口教授在被问及他们的新方法的重要性时说。

研究小组还能够证明，当大肠杆菌细胞受到热休克和抗生素治疗时，PETEOS可以捕获新生组的“屏幕截图”-在任何给定时间存在的新生pep-tRNA池。PETEOS在热应激下捕获急性蛋白质表达的能力以及暴露于不同抗生素后新生组的重排方面优于传统方法。

PETEOS确实存在一些局限性，包括使用LC-MS/MS分析低丰度PEP-tRNA的困难，由于酸性苯酚/氯仿步骤而导致定量容量有限，没有密码子水平的分辨率，以及难以捕获生长多肽的C端。然而，传统方法也存在其中一些问题，可以通过提高该过程的C端肽富集效率来克服。

该团队认为，优化他们的协议具有巨大的潜力。