噬菌体展示七肽序列结合显著提高抗菌肽对金黄色葡萄球菌的特异性靶向能力

抗生素作为对抗微生物感染的有效手段，广泛应用于临床治疗和动物生产。抗菌肽作为抗生素的潜在替代品，已显示出良好的应用前景。然而，由于抗菌肽具有广谱抗菌作用，大多数抗菌肽容易导致宿主肠道菌群失衡。此外，全身使用广谱药物治疗局部感染可能引起毒性，这一点不容忽视。

噬菌体展示技术是将编码外源蛋白质或小分子多肽的DNA片段与编码表面蛋白的噬菌体基因融合，以融合蛋白的形式存在于噬菌体表面。外源蛋白质和小分子多肽能够特异性地识别并结合靶分子。因此，该技术在靶向药物筛选、疫苗和单克隆抗体制备、肿瘤监测和诊断等方面被广泛应用。

本研究利用噬菌体展示技术，以金黄色葡萄球菌6538为目标菌，从随机肽库中筛选出9条七肽序列(图1)，选取亲和力最高的七肽序列(SYWVRAS)作为目标结构域。研究人员将该七肽序列通过GGG作为连接子与富含疏水性氨基酸的Temporin‐SHf连接，并在C端添加多个阳离子氨基酸(R或K)，进一步提高其抗菌活性。与Temporin‐SHf相比，设计的肽对金黄色葡萄球菌具有更高的特异性抗菌活性。说明筛选出的七肽序列与模板肽连接后，有效提高了特异性抗菌活性。

为了进一步验证SFK2处理对膜完整性的影响，将金黄色葡萄球菌6538与终浓度为8μM的SFK2孵育，在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光分布(图2A)。8μM SFK2诱导的金黄色葡萄球菌ATCC 6538的绿色荧光(SYTO9)和红色荧光(PI)重叠，表明其细胞膜严重破坏并导致细胞死亡。随后，为探究SFK2的靶向能力，将金黄色葡萄球菌ATCC 6538和大肠杆菌ATCC 25922按1:1混合，用8μM SFK2处理，然后加入SYTO9和PI荧光染料，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。在8 μM浓度的SFK2诱导下，金黄色葡萄球菌ATCC 6538的绿色荧光和红色荧光发生重叠，而大肠杆菌ATCC 25922只发绿色荧光而没有发红色荧光(图2B)，表明其膜完整性未受到破坏。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌与不同浓度的 SFK2 一起孵育，并使用流式细胞术定量其膜完整性。8、4 和 2 μM 的 SFK2 分别导致 92.78%、70.08% 和 28.38% 的金黄色葡萄球菌死亡率。然而，即使在最终浓度为 8 μM SFK2 时，铜绿假单胞菌和大肠杆菌的存活率仍超过 90%，与对照组的差异可以忽略不计(图 2C)。

为了进一步验证这一假设，利用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察了SFK2处理后金黄色葡萄球菌的形态变化。SEM下未处理的金黄色葡萄球菌表面完整、光滑圆整(图2D)。用2 μM SFK2处理2 h后金黄色葡萄球菌破裂，有内容物流出细胞外。TEM下(图2E)可见对照组金黄色葡萄球菌细胞膜结构完整，胞浆致密。用2 μM SFK2处理2 h后，金黄色葡萄球菌细胞膜破裂，细胞内容物流出。

研究人员构建并评估了小鼠腹腔注射全身感染模型，两种给药方式均显著减少脏器内菌落数量，肝细胞破裂、炎症细胞浸润等症状与生理盐水对照相比大幅减轻(图3)。由于仔猪在解剖、生理、营养代谢等方面与人类相似，他们进一步以仔猪为模型验证了SFK2的体内效果(图4)，发现在治疗金黄色葡萄球菌感染的仔猪模型中，SFK2在体内仍然保持活性。这些结果表明利用噬菌体展示技术筛选的七肽序列可以有效提高肽对金黄色葡萄球菌的特异性靶向能力，为后续窄谱抗菌药物的研发提供参考。