新的基于CRISPR的工具可以剪掉有缺陷的基因并用新的基因替换它们

在CRISPR基因编辑系统的基础上，麻省理工学院的研究人员设计了一种新工具，可以以更安全、更有效的方式剪掉有缺陷的基因并用新基因替换它们。

使用这个系统，研究人员表明他们可以将长达36,000个DNA碱基对的基因传递给几种类型的人类细胞，以及小鼠的肝细胞。这种被称为PASTE的新技术有望治疗由具有大量突变的缺陷基因引起的疾病，例如囊性纤维化。

这是一种新的遗传方法，可以针对这些真正难以治疗的疾病。我们想朝着基因疗法最初应该做的方向努力，即取代基因，而不仅仅是纠正个体突变。”

OmarAbudayyeh，麻省理工学院麦戈文大脑研究所麦戈文研究员

这种新工具结合了CRISPR-Cas9的精确定位，CRISPR-Cas9是一组最初源自细菌防御系统的分子，与称为整合酶的酶结合在一起，病毒使用这种酶将自己的遗传物质插入细菌基因组。

“就像CRISPR一样，这些整合酶来自细菌和感染它们的病毒之间的持续斗争，”麦戈文研究员乔纳森·古腾伯格(JonathanGootenberg)说。“它说明了我们如何能够不断从这些自然系统中找到大量有趣且有用的新工具。”

Gootenberg和Abudayyeh是这项新研究的资深作者，该研究今天发表在NatureBiotechnology上。该研究的主要作者是麻省理工学院技术助理MatthewYarnall和RohanKrajeski、前麻省理工学院研究生EleonoraIoannidi和麻省理工学院研究生CianSchmitt-Ulms。

DNA插入

CRISPR-Cas9基因编辑系统由一种称为Cas9的DNA切割酶和一条短RNA链组成，后者将酶引导至基因组的特定区域，指导Cas9在何处进行切割。当Cas9和靶向疾病基因的指导RNA被输送到细胞中时，基因组中会产生特定的切口，细胞的DNA修复过程会将切口粘合在一起，通常会删除基因组的一小部分。

如果还提供了DNA模板，细胞可以在修复过程中将正确的副本整合到它们的基因组中。然而，这个过程需要细胞在其DNA中进行双链断裂，这可能会导致对细胞有害的染色体缺失或重排。另一个限制是它只适用于分裂的细胞，因为非分裂细胞没有活跃的DNA修复过程。

麻省理工学院的团队想要开发一种工具，可以切除有缺陷的基因并用新基因替换它，而不会引起任何双链DNA断裂。为了实现这一目标，他们求助于称为整合酶的酶家族，称为噬菌体的病毒利用这些酶将自身插入细菌基因组。

在这项研究中，研究人员专注于丝氨酸整合酶，它可以插入大块DNA，大至50,000个碱基对。这些酶以称为附着位点的特定基因组序列为目标，这些位点起到“着陆垫”的作用。当他们在宿主基因组中找到正确的着陆点时，他们就会与之结合并整合他们的DNA有效载荷。

在过去的工作中，科学家们发现开发这些用于人类治疗的酶具有挑战性，因为着陆垫非常特殊，而且很难重新编程整合酶以靶向其他位点。麻省理工学院的团队意识到，将这些酶与插入正确着陆点的CRISPR-Cas9系统相结合，可以轻松地对强大的插入系统进行重新编程。

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新工具PASTE(通过位点特异性靶向元素进行可编程添加)包括一种Cas9酶，它在特定基因组位点进行切割，由与该位点结合的RNA链引导。这使他们能够针对基因组中的任何位点插入着陆点，其中包含46个DNA碱基对。这种插入可以在不引入任何双链断裂的情况下完成，方法是首先通过融合逆转录酶添加一条DNA链，然后添加其互补链。

一旦结合了着陆点，整合酶就会出现并将其更大的DNA有效载荷插入到该位点的基因组中。

“我们认为这是朝着实现可编程插入DNA的梦想迈出的一大步，”Gootenberg说。“这是一种可以很容易地针对我们想要整合的站点和货物进行定制的技术。”

基因置换

在这项研究中，研究人员表明他们可以使用PASTE将基因插入多种类型的人类细胞，包括肝细胞、T细胞和淋巴母细胞(未成熟​​的白细胞)。他们使用13种不同的有效载荷基因(包括一些可能具有治疗作用的基因)测试了递送系统，并能够将它们插入基因组的九个不同位置。

在这些细胞中，研究人员能够以5%到60%的成功率插入基因。这种方法还在基因整合位点产生了极少不需要的“插入缺失”(插入或缺失)。

“我们看到的插入缺失很少，而且因为我们没有制造双链断裂，所以你不必担心染色体重排或大规模染色体臂缺失，”Abudayyeh说。

研究人员还证明，他们可以将基因插入小鼠的“人源化”肝脏中。这些小鼠的肝脏由大约70%的人类肝细胞组成，PASTE成功地将新基因整合到大约2.5%的这些细胞中。

研究人员在这项研究中插入的DNA序列长达36,000个碱基对，但他们相信还可以使用更长的序列。一个人类基因的范围可以从几百到超过200万个碱基对，尽管出于治疗目的只需要使用蛋白质的编码序列，从而大大减少需要插入基因组的DNA片段的大小。

研究人员现在正在进一步探索使用该工具作为替代有缺陷的囊性纤维化基因的可能方法的可能性。该技术还可用于治疗由缺陷基因引起的血液疾病，例如血友病和G6PD缺陷，或亨廷顿氏病，这是一种由具有过多基因重复的缺陷基因引起的神经系统疾病。

研究人员还在网上提供了他们的基因结构，供其他科学家使用。

“设计这些分子技术的一个奇妙之处在于，人们可以以我们可能没有想到或没有考虑过的方式构建、开发和应用它们，”Gootenberg说。“成为这个新兴社区的一员真的很棒。”

该研究由瑞士国家科学基金会博士后流动奖学金、美国国立卫生研究院、麦戈文研究所神经技术项目、K.LisaYang和HockE.Tan神经科学分子治疗中心、G.Harold和LeilaY资助.MathersCharitableFoundation、MITJohnW.Jarve科学创新种子基金、ImpetusGrants、囊性纤维化基金会先锋基金、GoogleVentures、FastGrants和McGovernInstitute。