使用共聚焦显微镜了解环境微生物组

共聚焦技术是光学显微镜领域最重要的进步之一，德克萨斯A&MAgriLife和德克萨斯A&M大学系统其他部分的许多学科都发现它也可以成为他们研究中的游戏规则改变者。

德克萨斯A&M农业与生命科学学院植物病理学与微生物学系PLPM教授BrianShaw博士是共聚焦显微镜方面的专家。他不仅将这项最先进的技术应用于自己的研究，还鼓励本科生和研究生以及其他研究人员使用它来推进自己的科学工作。

什么是共聚焦显微镜?

“与传统显微镜相比，共聚焦显微镜具有多项优势，包括能够控制景深以及减少或消除焦平面上图像形成中的离焦光，”Shaw解释道。

“它还使您能够处理活细胞并实时查看它们所做的变化，以及从厚标本中收集连续切片，”他说。“此外，它可以生成细胞的近乎3D图像，让您可以从不同的角度查看它。”

Shaw的主要共聚焦显微镜位于得克萨斯A&M校园的植物病理学和微生物学大楼内，可提供广泛的成像模式。

这是一款奥林巴斯FV3000共聚焦激光扫描显微镜，具有四个检测器和六条激光线，可以同时对几乎任何荧光团的四色通道进行成像。它是完全电动的，具有自动对焦功能，可以在不失去焦点的情况下进行数小时的延时成像。显微镜的精密电动载物台可以同时对各种标本进行多点延时。

共聚焦显微镜和确定病原体感染

根据国际微生物生态学会官方期刊《微生物生态学多学科期刊》的研究，超过80%的作物病害是由真菌或类真菌病原体引起的。这些疾病导致数十亿美元的作物损失并威胁粮食安全。

肖说，他和他的团队所做的大部分研究都与确定参与真菌生长和发育的细胞机制以及真菌病原体的工作方式有关。

“我们正在研究真菌孢子的表面特征以及它们如何影响孢子的传播，”他说。“真菌孢子是这些生物体用来跨越距离和时间传播的休眠细胞。”

肖说，真菌需要极化的菌丝生长才能对植物和人类产生影响，因此了解菌丝是如何产生的是一个基本问题。菌丝是丝状真菌的基本单位，通常由一连串细长的细胞组成，这些细长的细胞在尖端细胞的顶端扩张。细长的线状细胞仅在高度极化的顶端生长，其生长的特点是最初建立一个生长位点，然后持续维持。

“我们的实验室检查了真菌菌丝生长和发育过程中细胞骨架成分的时间和空间动态，”他说。“使用共聚焦显微镜，我们发现重要的玉米病原体Colletotrichumgraminicola的孢子是不对称的。这些孢子只能附着在孢子的一个面上的新宿主上。”

Shaw说，由于依附在新宿主上是开始玉米病害循环所必需的，因此这一发现确定了破坏玉米真菌病害的新的重要目标。

“借助这种更高分辨率、几乎是3D的图像，我们能够推断出附着部位与真菌病原体感染部位之间的相关性，”他说。“共聚焦显微镜使我们能够在以前无法获得的细节水平上看到这些结构及其成分。现在我们可以更好地了解真菌的生长方式并识别特定真菌的菌丝及其在疾病发生中的作用。”

本科生和研究生使用共聚焦显微镜

在Shaw实验室工作的植物病理学和微生物学系研究生OliBedsole说，他使用共聚焦显微镜研究不同的蛋白质如何在真菌中相互作用和结合。

“我正在研究真菌孢子中的粘合剂，这种粘合剂可以让它们附着并随后感染植物，如玉米，”Bedsole说。“共聚焦的分辨率是最重要的，它让我可以看到粘合剂的位置、特定蛋白质的位置以及它们如何相互作用。”

Bedsole说他从Shaw和其他实验室成员那里学到了共聚焦显微镜的基础知识，然后通过研究生课程“光学显微镜理论与应用”接受了进一步的培训。

“我们几乎只对活细胞样本进行成像并获得令人难以置信的分辨率，”他说。“共聚焦显微镜使我们能够制作3D结构，为我们提供独特的视角和清晰度。它也是帮助我们与其他人交流我们的科学的强大工具，因为他们可以看到这个3D图像。”

与Bedsole一起工作的本科生MaryCowser说，共聚焦显微镜的图像有助于将科学带入生活。

她说：“通过对真菌结构的不同部分进行染色来创建色彩鲜艳的图像，从而为我们提供了一种用颜色增强的结构图像。”“并且能够在3D结构中看到实时生长的结构非常有趣，并且可以深入了解它们的运作方式。拥有这些图像有助于我们更多地了解病原体及其机制，这有利于环境科学。”

用激光扫描共聚焦显微镜对真菌炭疽菌的孢子进行成像。图片来源：TexasA&MAgriLife/MichaelMiller

Bedsole、Cowser和Shaw班上的其他人都接受了与生物科学技术相关的专业培训和丰富的经验。

“共聚焦显微镜在微生物学和环境科学中有多种应用，”Shaw说。“接受有关使用这项技术的培训可以为环境科学专业的学生提供额外的经验和专业知识，如果他们从事解决环境中的生物学问题的职业，技术本身对他们有很大的好处。”

德州农工大学多学科使用共聚焦显微镜

Shaw说，除了在植物病理学、微生物学和生物环境科学中的整体应用外，共聚焦显微镜还有益于其他学科。

Shaw和他的团队与德州A&M的其他研究人员合作，跨学科和多学科地使用这项技术来推动科学发展。

例如，艺术与科学学院生物系教授MatthewSachs博士和研究生MatthewBreuer一直在使用共聚焦显微镜研究对抗真菌病原体的新方法。

在他们正在研究的真菌病原体中，新型隐球菌是每年约有181,000人死亡的罪魁祸首。新型隐球菌引起的脑部感染称为隐球菌性脑膜炎，主要发生在撒哈拉以南非洲。

Sachs说，在他的研究中使用共聚焦显微镜是必不可少的，以了解舍曲林(一种常用的抗抑郁药)作为抗真菌治疗的潜在功效。

他说：“治疗方法的匮乏和对当前疗法的耐药性不断增加，凸显了开发或鉴定适合临床使用的新型抗真菌药物的必要性。”“我们之前的研究表明舍曲林具有抗真菌特性，将FDA批准的现有化合物(如舍曲林)重新用作抗真菌疗法可能是一种高效且有效的策略。”

Sachs和他的团队使用共聚焦显微镜获得了活隐球菌细胞的高分辨率图像，并观察它们如何受到舍曲林的影响。

“我们与Shaw博士合作获得的这些图像对于指导我们的研究和了解我们应该将精力集中在何处以发现可以帮助我们对抗真菌感染的重要联系至关重要，”他说。

在与Shaw实验室的另一项合作中，工程学院WmMichaelBarnes'64工业与系统工程系教授ZJPei博士和生物系副教授HongminQin博士，与其他人一起使用共聚焦显微镜进行与使用植物或藻类细胞进行生物打印相关的研究。

“之前关于挤压压力和针头直径对生物打印中细胞活力影响的研究使用的是动物细胞，但之前没有关于它们如何影响使用植物或藻类细胞的细胞活力的报道，”裴说。“细胞数量是细胞活力的主要指标，我们的团队使用共聚焦显微镜来测量3D打印样品的细胞数量。”

“使用藻类进行生物打印：挤出压力和针头直径对打印样品中细胞数量的影响”的结果发表在美国机械工程师协会的出版物《制造科学与工程杂志》上。

“了解挤压压力和针头直径对藻类细胞数量的影响趋势将有助于用藻类进行打印，特别是在确定正确的挤压压力和针头直径水平方面，”Pei说。

Shaw和Pei还在合作开发3D打印真菌定植的生物废料(例如稻壳或稻草)用作建筑材料的技术。

对环境微生物组的更重要研究

SanjayAntony-Babu博士是植物病理学和微生物学系的助理教授，他使用共聚焦显微镜来了解更多关于“病原体”或微生物组如何影响引起植物病害的土壤真菌的信息。

Antony-Babu与得克萨斯州A&M农业生命推广服务中心植物病理学家TomIsakeit博士密切合作，表示他们正在研究镰刀菌的致病菌，这种真菌会导致包括棉花在内的各种作物枯萎。

“这种植物真菌是一个全球性问题，会在全球范围内造成棉花作物的破坏和损失，”他说。“我们正在研究可能附着什么细菌并帮助这种致病真菌。”

Antony-Babu表示，土壤微生物组非常复杂，在一克土壤中可能发现超过100亿个细菌。

“土壤中没有任何生物是孤立的。直到最近，我们才能够将它们作为群体而不是个体来研究，”他说。“共聚焦可视化是我们研究微生物组的一种主要方式。”

Antony-Babu说，他的团队使用了一种真菌诱饵技术，在这种技术中，致病真菌会招募具有天然吸引力的细菌。

“我们还结合使用分子和成像技术——DNA/RNA测序方法、基于培养的分析和共聚焦成像——来找出哪些生物体直接相互作用以引发植物病害，”他说。

Shaw还与植物病理学和微生物学系教授JeanmarieVerchot博士合作，她的研究重点是病毒与宿主的相互作用，使用共聚焦显微镜记录病毒在植物中的复制。

“真菌是我们周围环境微生物组的重要组成部分，”肖说。

他指出，真菌通过降解有机废物在营养循环中发挥作用，并在影响植物和动物的许多疾病中发挥作用。

“在我们的建筑环境中，还有毒真菌孢子会降低空气质量的威胁，因此真菌每天都会影响我们所有人，”肖说。

他说，使用先进的共聚焦显微镜了解真菌如何在环境中繁殖和生长是人类健康和繁荣的关键，也是生物环境科学的重要组成部分。