如何提取DNA粗提和精提的方法？ 精胺检测方法

网上有很多关于如何提取DNA粗提和精提的方法？的问题，也有很多人解答有关精胺检测方法的知识，今天每日小编为大家整理了关于这方面的知识，让我们一起来看下吧!

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一、如何提取DNA粗提和精提的方法？

二、测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些？为什么一般分析报告显示17种氨基酸成分？

一、如何提取DNA粗提和精提的方法？

一、DNA提取(粗提)1、酚提取法：先用卵酶K和SDS破碎细胞，消化蛋白质，再用大小为100-150kb的酚和酚氯DNA解聚2、甲酰胺法：细胞同上破碎，再用甲酰胺解聚。

3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解液铺在乙醇上，然后用钩子或U形玻璃棒在界面处轻轻搅拌，DNA沉淀缠绕在玻璃棒上。产生的DNA约为80kb。4、异丙醇沉淀法：基本与第一种方法相同，仅用2倍体积的异丙醇代替乙醇，可去除小分子RNA(溶于异丙醇)5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，再用蛋白酶K或苯酚去除蛋白质，用乙醇沉淀或透析。

6、加热法快速制备：96-100加热五分钟，然后离心取上清液，可用于PCR反应。7、碱变性快速制备：先用NaOH 20分钟，再加入HCl中和，离心后取上清液，含少量DNA。二、DNA浓度(精制提取)1、固体聚乙二醇(PEG)浓度：用透析袋将PEG涂抹至适量。2、丁醇提取和浓缩：DNA溶液中的水可以分配到正丁醇或仲丁醇中，但DNA不会。因此，重复几次可以显著减少DNA体积。

3、乙醇或异丙醇沉淀：(1)需要阳离子盐，NaAc最常用，NaCl对含SDS的样品好，NH4Ac对去除dNTP好。PiCl能很好地沉淀RNA，但在逆转录前不能使用。(2)沉淀温度和时间；0-4，12000g，10分钟，小于100 BP的DNA需要超速离心。4、精胺沉淀法：与DNA结合后，DNA结构在无盐或低盐溶液中浓缩沉淀。

二、测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些？为什么一般分析报告显示17种氨基酸成分？

一般来说人体必需的氨基酸有17种，比较注重氨基酸的定性一、氨基酸的通用显色反应。本节介绍了三种显色反应：茚三酮法、靛醌法和邻苯二甲醛法。前两种是经典的常用显色方法，后者是近几年发展起来的荧光显色方法，具有灵敏度高的特点。

1.茚三酮法显色有几种方法：常用方法：层析或电泳后，将有样品的滤纸上的溶剂完全除去，喷5g/L茚三酮无水丙酮溶液，充分干燥，置于65烘箱中约30min(温度不宜过高，以免空气中有氨，以免背景变红)，氨基酸斑点呈紫红色。为了使各种氨基酸呈现不同的颜色，可采用以下方法：(2)用0.4g茚三酮、10g苯酚和90g正丁醇的混合溶液显色。

(3)用1g/L茚三酮无水丙酮溶液显色结束后，用盐酸蒸汽熏蒸1分钟。用1克茚三酮、600毫升无水乙醇、200毫升冰醋酸和80毫升2，4，6-三甲基吡啶混合溶液在80下染色5 ~ 10分钟。为使显色稳定，可采用以下方法：配制含2g醋酸镉、200mL蒸馏水和40mL冰醋酸的贮存液。向上述贮存液中加入200mL丙酮和2g茚三酮，即为显色液。

将装有样品的滤纸浸入此显色液后，放入装有一小杯浓硫酸的密闭玻璃容器中，在25、18h或更高温度下适当缩短时间。背景颜色浅，氨基酸斑点比较稳定。用含2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L茚三酮异丙基丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，或茚三酮显色后喷含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点由蓝紫色变为红色。

2.靛醌法(1)原理各种氨基酸和靛醌试剂可以显示不同的颜色，因此可以用来鉴别氨基酸。氨不妨碍靛醌的显色，但灵敏度略差于茚三酮法，显色不稳定。颜色只能在绝对干燥的环境下保存。(2)试剂显色剂：1g靛醌溶于100mL乙醇和10mL冰醋酸中(如果减少冰醋酸用量，灵敏度会稍差)。

褪色剂：将60g硅酸钠(na 2 SiO 39H2O)加入100mL 200g/L碳酸钠溶液中，在水浴(60 ~ 70)中加热搅拌至完全溶解，直至溶液澄清。在溶解过程中，有时硅酸钠会形成凝胶，这时，只有继续搅拌才能溶解。配制时，如果硅酸钠用量大，颜色会很快褪色，但背景容易变黄。硅酸钠用量少(40g)，虽然显色慢，但背景比较白。

显色步骤层析或电泳后的滤纸干燥后，仔细喷洒或涂上显色剂，用电吹风快速吹干。当醋酸气味不太刺鼻时，移至100的烘箱中干燥5 ~ 15 min至显色(温度不宜过高，以免颜色减少)。注意显示的颜色，然后均匀地涂上底色退色剂，使纸张的底色由黄色变为深红色再逐渐变浅，当黄色底色几乎消失时。

如苏氨酸褪色前呈红棕色，褪色后呈橙色或黄色：脯氨酸褪色前呈蓝色，干燥后很快褪色至无色。当室温较低时，背景颜色会慢慢变淡。此时可将退色剂加热至30 ~ 40。过高的温度是不合适的，因为氨基酸斑点的褪色速度也会加快，应该避免。其他显色步骤：显色剂为1克吲哚醌，将1.3克醋酸锌溶于70 ~ 80毫升热异丙醇中，冷却后加入1毫升吡啶。

或者将1克吲哚醌和1.5克醋酸锌溶于95毫升热异丙醇中，加入3毫升水，冷却后加入1毫升冰醋酸。将装有样品的滤纸仔细喷上显色剂，在80 ~ 85放置10分钟后，背景可迅速用水浸湿，氨基酸斑点不褪色。由于靛醌试剂的制备方法不同，同一种氨基酸的颜色往往不同。

3.邻苯二甲醛法邻苯二甲醛法是目前纸层析和硅胶薄层层析最灵敏的方法之一。它还可以用于氨基酸溶液的定量，并广泛用于乙内酰脲氨基酸、肽和蛋白质的检测和定量。据文献报道，氨基酸纸层析的灵敏度为0.5moL，硅胶薄层层析的灵敏度为0.05 ~ 0.2 mol。本文介绍了在纸色谱上展开氨基酸的方法。

(荧光素是另一种常用的荧光试剂，由于来源困难，此处不作介绍)(1)原理邻苯二甲醛在碱性溶液中，在2-巯基乙醇存在下与氨基酸反应生成荧光化合物，最佳激发和发射波长分别为340nm和455nm。

各种氨基酸的荧光强度不同，其相对荧光强度依次为：天冬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、NH3、脯氨酸、半胱氨酸。

（2）试剂邻苯二甲醛显色液：取0.1g 邻苯二甲醛，0.1mg 巯基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油醚（6090）（1+1）的混合溶剂至100mL。放置0.5h 后使用。显色步骤将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中1min，冷风吹干，在温度18以下，湿度50%90%之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。说明在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以0.1%为宜。

显色时必须有一定的湿度，以便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。二、个别氨基酸的显色反应利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电泳显色，也可单独应用。

方法很多，仅将常用的方法介绍如下：1精氨酸的显色——坂口（Sakaguchi）反应(1)第一种方法试剂：5g 尿素溶解于100mL0.1g/L-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加约5g KOH。0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂后，在空气中吹几分种，再喷试剂。精氨酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。

(2)第二种方法：试剂：1g/L 8-羟基喹啉的丙酮溶液。0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶液中。显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂，吹干后，再喷试剂。精氨酸或其他胍类物质显桔红色。2胱氨酸和半胱氨酸的显色试剂：1.5g 亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液中，加95mL 甲醇。此时会有沉淀产生，可保存一个月以上。

使用时在每100mL 上述溶液中加10mL 28%氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持一天左右。2g 氰化钠溶于5mL 水中，然后加95mL 甲醇。此时有沉淀产生，使用时只需摇匀即可。显色步骤：半胱氨酸的显色：在滤纸上喷以试剂的清液，5min 后半胱氨酸显红色。胱氨酸的显色：先将滤纸浸入试剂，迅速取出，稍等片刻再喷试剂甲的清液，5min 后胱氨酸显红色。

也可以把试剂配制的浓度增加一倍，在显色前混和，再喷到滤纸上。3甘氨酸的显色试剂；0.1g 邻苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍有效。以甘氨酸为N 端的小肽也能显色，但其N 端被保护后，以及其他氨基酸均不显色。

4脯氨酸的显色试剂：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸锌，1mL 醋酸，5mL 蒸馏水混和，再加入95mL 异丙醇。新鲜配制。显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上以上试剂，8085烘箱内放置30min，脯氨酸显蓝色，再以30温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。也可剪下脯氨酸斑点，在试管中加入5mL 水饱和酚，在黑暗中洗脱15min，间歇振摇，于610nm 测定其吸光度。

从已知标准曲线即可求得样品内脯氨酸含量，测定范围520g。5丝氨酸和羟赖氨酸的显色试剂：0.035mol/L 过碘酸钠（748mgNaIO4 溶于数毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 盐酸，再用甲醇稀释至100mL）。15g 醋酸铵加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀释到100mL。

显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂，近干后再喷试剂，室温放置2h，紫外灯下照射0.5h，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。6羟脯氨酸的显色试剂：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。1g 对二甲胺苯甲醛溶于100mL的丙酮浓盐酸（91）混合液中。（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深发黑，灵敏度降低，故用时新鲜少量配制。

显色步骤：将待鉴定的溶液点于小方块纸上，干后先点上试剂，热风吹干。这时纯羟脯氨酸呈墨绿色，纯脯氨酸呈深蓝色（极灵敏），对其他氨基酸呈程度不同的紫红色（不太灵敏）；然后再点上试剂吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色，而其他氨基酸与吲哚醌所生成的颜色则褪去。

7色氨酸的显色(1)第一种方法试剂：1g 对二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 浓盐酸。新鲜配制。显色步骤：点有样品的滤纸干燥后，喷上以上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸显蓝色或紫红色。茚三酮显色后，仍可使用本法。(2)第二种方法：试剂：10mL 35%甲醛加10mL25%盐酸，20mL 无水乙醇。

显色步骤：点有样品的滤纸喷上以上试剂后，100烘5min，色氨酸在长波长紫外光下呈现荧光（黄-橙-带绿色）。8酪氨酸的显色试剂：0.1%-亚硝基-萘酚的95%乙醇溶液。10%硝酸水溶液。显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂后，吹干，再喷试剂，然后在100烘3min，酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，0.5h 后转变为桔红色，其后渐退去。

灵敏度12g 酪氨酸。茚三酮显色后，再用此试剂处理，仍能显色，茚三酮所显出的紫红色斑点变成红色。9酪氨酸和组氨酸的显色——pauly 反应试剂：4.5g 对氨基苯磺酸与45mL 12mol/L 盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至500mL。用时取出30mL，在0与等体积的5%亚硝酸钠水溶液相混合。（室温放置太长会失效）10%碳酸钠水溶液。

显色步骤：点有样品的滤纸上喷试剂，片刻后再喷试剂。组氨酸及含组氨酸的多肽显桔红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。第六节氨基酸定量测定一、氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法1原理氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。

这样就可以用标准强碱溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如下：2方法特点及应用此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。

脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。

3操作方法吸取含氨基酸约20mg 的样品溶液于100mL 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL 烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL 数，供计算总酸含量。加入10.0mL 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。

同时取80mL 蒸馏水置于另一200mL 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH82，（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。

4结果计算氨基酸态氮质量分数（%）=式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmoL。

5说明本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。浑浊和色深样液可不经处理而直接测定。(二)茚三酮比色法1原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。

2操作方法(1)标准曲线绘制准确吸取200g /mL 的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于0、100、200、300、400、500、600g 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH 为8.04）各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。

静置15min后，在570nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。(2)样品测定吸取澄清的样品溶液14mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，用测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。

3结果计算氨基酸含量（mg/100g）=式中：c——从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，g；m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。4说明及注意事项通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品510g 或吸取样液样品510mL，置于烧杯中，加入50mL 蒸馏水和5g 左右活性炭，加热煮沸，过滤，用3040mL 热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL 容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。

茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编著《食品检验与分析》 。(三)非水溶液滴定法1原理氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。

根据酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。

本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸2测定(1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg 左右，溶解于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L 高氯酸标准液滴定（用10mL 体积的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至同样终点颜色。

(2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品3040mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸标准溶液中，加2 滴甲基紫指示剂，剩余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。

3说明(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。

(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。(四)邻苯二甲醛法(OPT 法)1原理邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340 和455nm。

可能产物为：各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高100 倍以上，可测到0.11104mol 氨基酸。

如用于血清中-氨基氮的测定，每次血清用量只需510L。与另一种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。

(五)三硝基苯磺酸法三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS 在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物，如下式所示：中间络合物在光谱上有二个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值显著下降，而350nm 附近的吸收峰则移至340nm 处。

利用TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。下表列出各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条件下测定的吸光度。在340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度因氨基酸种类而异；在加入适量SO32时，吸收值升高。本法允许的测定范围是0.050.4mol 氨基酸。

表10-3 各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条件下测定的吸光度氨基酸种类碱性溶液 酸性溶液加SO3取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40反应2h，用水补充至4mL，在420nm 处测定。制作氨基酸浓度—吸光度坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1mol 时的吸光度。条件同上，但在与TNBS 反应时加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后总体积也是4mL，同样在420nm 处测定。

条件同，但与TNBS 反应后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 处测定。(六)乙酰丙酮和甲醛荧光法1原理氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。主要反应如下：乙酰丙酮甲醛氨基酸荧光物质2试剂混合试剂：取1mol/L 乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，用水稀释至30mL。

3测定取氨基酸液1mL，加入混合试剂1mL，用棉花塞满试管口，避光于100下加热10min，冷却，加水2mL，然后测定荧光值。表10-4 各种氨基酸的发射波长和检测范围化合物（激发波长405nm） 发射波长（nm） 检测范围（mg/L）甘氨酸485 210苯丙氨酸490 840丝氨酸485 525半胱氨酸（盐酸盐） 500 20100谷氨酸485 20100与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。

二、个别氨基酸的定量测定（一）赖氨酸的测定1原理用铜离子阻碍游离氨基酸的-氨基，使赖氨酸的-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基苯(FDNB)反应，生成-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取，在波长390nm 处有吸收峰，从而求出样品中游离赖氨酸的含量.2试剂(1)氯化铜液：称28.0g 无水氯化铜，用水稀释至1000mL。(2)磷酸三钠溶液：称68.5g 无水磷酸钠，用水稀释至1000mL。

(3)硼酸盐缓冲液（pH9.19.2）：称54.64g 带有10 结晶水的四硼酸钠，用水稀释至1000mL 。(4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液200mL，缓慢倒入400 mL 的磷酸三钠溶液中，把悬浮液以2000r/min 速度离心5min ，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3 次，把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀释至100mL。

(6)赖氨酸-HCl 标准溶液：称取一定量赖氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作标准液。(7)100g/L 丙氨酸溶液。3测定(1)称取通过40 目筛的均匀试样1.00g，置于100mL 烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl 标准工作液5mL（相当1mg 赖氨酸-HCl），连同试剂空白同时进行试验。(2)向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。

吸取10NB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中，将烧瓶置沸水中加热15min。(3)取出烧瓶，立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不断摇动使之酸化和分散均匀。(4)烧瓶中的溶液冷却至室温，用水稀释至100mL.取约40mL 悬浮液进行离心。(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中，于65水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。

(6)吸取上述各处理液10mL，分别与95%乙醇溶液10mL 混合，用滤纸过滤。(7)用试剂空白液凋零，测定样液A390nm，与赖氨酸-HCl 标准液对照，求出样品中赖氨酸-HCl 的含量。本法在040mg/L 赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。4说明(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸-HCl 浓度具有良好的线性关系。

(2)用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB的产物破坏，否则这些产物在390nm 处存在干扰。（二）色氨酸的测定1.原理样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。

2试剂(1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%38%)5.5mL，加水至100mL。

(3)色氨酸标准溶液：称取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,置棕色瓶中备用，使用时用水稀释成1mg/L 的标准溶液.3测定称取样品粉末100200mg 于离心管中，加入4mL 乙醚，摇匀后过夜，以3000r/min 速度离心。将乙醚提取液移入试管内，并用乙醚洗涤残渣3 次，收集乙醚液于试管中，于40水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110水解1624h。

水解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH68 后，用水定容至50mL,过滤备用。吸取滤液0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，摇匀后于100水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发波长为365nm，发射波长449nm 条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含量。本法在010mg/L 色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

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