Folin-酚法的试剂与器材 磷钼酸钠溶解度

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一、Folin-酚法的试剂与器材

一、Folin-酚法的试剂与器材

(1)试剂A(A、B)：(A)10g Na2CO3、2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠(KNaC4H4O64H2O)。溶于500毫升蒸馏水。 (B) 将0.5 g 硫酸铜(CuSO45H2O) 溶解在100 ml 蒸馏水中。每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即得试剂A。 （2）试剂B：加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）、25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）和将700毫升蒸馏水倒入2升磨口回流瓶中，再加入85%磷酸50毫升。 100毫升浓盐酸，混匀，接上回流管，小火回流10小时。过量的溴。冷却后，溶液变成黄色（如果还是绿色，必须重复加入液溴的步骤）。稀释至1 升，过滤，并将滤液储存在棕色试剂瓶中。使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，适当稀释后，加1倍左右的水，使终酸浓度为1N左右。 (3) 蛋白标准溶液： 准确称取结晶牛血清白蛋白或-球蛋白，用蒸馏水溶解，浓度约为250 mg/ml。如果牛血清白蛋白溶于水变浑浊，请改用0.9% NaCl 溶液。取16支大试管，1支为空白，3支为未知样品，其余试管分为两组，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准蛋白溶液（浓度为250mg/ml ) 。加水定容至1.0 ml，然后向每支试管中加入5 ml Reagent A，在涡旋混合器上快速混匀，室温（20-25）放置10分钟。然后逐一加入0.5ml试剂B（福林酚试剂），立即混匀。这一步搅拌速度要快，否则显色会减弱。然后室温静置30分钟，用第一支不含蛋白溶液的试管作为空白对照，在700nm处测定每管溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。注意：由于Lowry反应颜色随时间加深，每次操作必须准确控制，即在第一支试管中加入5ml试剂A后，开始计时，1分钟后，加入5ml试剂A加入第二支试管，2分钟后加入第三支试管，依此类推。如果所有试管加入试剂A后已超过10分钟，立即在第一支试管中加入0.5ml试剂B，1分钟后在第二支试管中加入0.5ml试剂B，加入第三次检测2分钟后管。比喻。最后一支试管加入试剂后，再静置30分钟，然后开始测吸光度。每分钟测量一个样品。为了防止在进行多试管操作时出错，每个学生都必须在实验记录本上预先画出下表。每支试管的加入量（ml）见表，按从左到右、从上到下的顺序逐管加入。底部两行是计算出的每管蛋白质含量（以微克为单位）和测得的吸光度值。取1ml样品溶液（约含20-250微克蛋白质），按上述方法操作，取1ml蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起同时进行。即每支试管作标准曲线测定后加3支试管。8、9、上表中的10个试管。根据被测样品的吸光度值，在标准曲线上找出相应的蛋白量，从而计算出样品溶液的蛋白浓度。请注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，因此显色强度往往因蛋白质而异。因此，这种测定通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。福林-酚法测定蛋白质含量的原理磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下易被酚类化合物还原而呈蓝色。蛋白质中含有酚类酪氨酸，故有此反应。福林酚法的灵敏度是缩二脲法的100倍。苯酚和柠檬酸干扰测定，低浓度尿素、胍、硫酸钠、硝酸钠、三氯乙烯、乙醇、乙醚、丙酮对显色无影响。

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