雷帕霉素的作用机理 雷帕霉素自噬诱导剂

网上有很多关于雷帕霉素的作用机理的问题，也有很多人解答有关雷帕霉素自噬诱导剂的知识，今天每日小编为大家整理了关于这方面的知识，让我们一起来看下吧!

内容导航：

一、雷帕霉素的作用机理

二、细胞自噬

:

一、雷帕霉素的作用机理

雷帕霉素阻断不同细胞因子受体的信号转导，阻断T淋巴细胞和其他细胞从G1期向S期的进展。它可以阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和钙非依赖性信号转导途径。与FK506一样，雷帕霉素与相同的免疫亲和蛋白（亲免素）FKBP12结合，形成RAPA-FKBP12复合物，不能与钙调蛋白结合，并且雷帕霉素不会抑制T细胞的早期激活，也不会直接训练食物来减少T细胞的合成。细胞因子。该复合物的靶蛋白首先在酵母中被发现，称为TOR1 和TOR2。

最新研究发现雷帕霉素（rapamycin）是一种有效的自噬诱导剂Fareifu，可能通过诱导自噬来减轻炎症反应，这可能是其免疫抑制的机制之一。

:

二、细胞自噬

自噬被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对同伴压力源（例如营养剥夺）的反应，这可能会损害细胞的生存。自噬以低水平发生，以平衡生物分子的持续合成，当细胞暴露于这些应激源时，自噬会急剧上调。这种上调增加了细胞的摄取和降解，将大分子释放回细胞质中，以驱动必要的代谢反应并产生能量。

在正常和应激条件下，自噬对细胞健康的贡献意味着这一严格调控和精确协调的过程具有重要的生理和病理作用。事实上，自噬被发现在哺乳动物发育过程中很有用。此外，最近的研究已确定自噬是各种疾病和病症的重要调节因子。探索自噬在发育和疾病中的参与对于更全面地了解该途径的作用至关重要，并且可能对维持健康或治疗疾病具有影响。

自噬的研究已经成为当今医学研究中的常客，发表的论文量也非常大。它已经成为一种常规的生物现象来研究，但是有一些实验技术值得讨论，比如一些试剂的使用等。

：1、自噬相关试剂的使用。

取MDC:粉末12 mg，溶于720 nl DMSO中，使浓度为50 mmol/L，分装后保存于-20冰箱中。使用前用MEM稀释至终浓度50umol/L；

雷帕霉素：用MEM培养基配制至终浓度1umol/L，配制使用；

400ng/ml 喹乙醇： 称取4 mg 喹乙醇，预溶解于DMSO（体积比0.1%）中，加入10 ml MEM 培养基至完全溶解，立即配制，避光保存；

3-MA:粉末先用PBS溶解，使用前加热至完全溶解，然后加入MEM培养基至终浓度10mmol/L； PI3K抑制剂（3-MA、Wortmannin）可以干扰或阻断自噬体的形成；

用雷帕霉素诱导自噬我也查了一些文献。它适用于无血清培养基，也适用于一般培养基。浓度范围为25nM至100nM。我使用50nM雷帕霉素并将其添加到普通培养基中。目的是排除无血清诱导的自噬。

文献称，饥饿初期大分子自噬被激活，4-6小时活性达到最大，24小时后以CMA途径为主。

sigma的EBSS，产品编号E2888，含有碳酸氢钠和酚红。酚红不是必须的，只是PH指示剂，看起来比较好

自噬的无血清诱导：EBSS诱导6小时就足够了。

EBSS肯定可以诱导，但是需要说明的是时间点的设置，因为自噬可能在饥饿诱导后半小时就开始了，一直持续到24小时，所以要设置不同的时间点来观察这个效果。还有一个大问题是，饥饿诱导的一大缺点就是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是细胞采用时蛋白浓度太小。 24小时都很少见了，更别说48小时、72小时了。

Hank's诱导，即通常所说的饥饿诱导，细胞培养至对数生长期后，用Hank's替代常规完全培养基，3小时后即可诱导自噬。用Hank's诱导3小时后，我用电镜观察到30%的细胞有自噬，但没有国外报道的那么高。

西格玛氯喹产品编号为C6628。氯喹用作自噬抑制剂，对于293T细胞50uM就足够了。 1.可用双蒸水配制2.配制后4度保存

不同的自噬抑制剂有不同的作用机制。抑制的步骤也不同。有些不能抑制lc3的切割，但可以抑制后续步骤。氯喹抑制自噬体和溶酶体的融合过程，自噬无法完成，因此lc3会积累。因此，添加抑制剂lc3后，会比不添加抑制剂时更高。氯喹可以升高溶酶体中的pH值，并使溶酶体中的酸性水解酶失活，导致“自噬溶酶体”无法降解。因此，膜上LC3的自噬和自噬溶酶体不能及时降解，表现为LC3荧光长期保留或WB中LC3条带增粗。

Z-VAD-FMK（caspase-3抑制剂）抑制EV71感染引起的细胞凋亡，并观察细胞自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡可以增加LC3-I向LC3-II的转化以及p62的降解。

1、雷帕霉素：作为最经典的mTOR靶向诱导剂，已得到广泛应用，推荐工作浓度为1mol-10mol；

2.氯喹：作为一种溶酶体抑制剂，氯喹（Chloroquine）可以抑制自噬体和溶酶体的融合，因此可以作为自噬和自噬流的抑制剂进行实验研究。推荐浓度：10umol-50umol。

:2、自噬诱导剂

正常培养细胞的自噬活性很低，不适合观察。因此，有必要人为干预和调控自噬。报告的药物包括：

(1) Bredeldin A/Thapsigargin/Tunicamycin：模拟内质网应激

（2）卡马西平/L-690、330/氯化锂（氯化锂）：IMPase抑制剂（即肌醇单磷酸酶、肌醇单磷酸酶）

(3)厄尔平衡盐溶液：制造饥饿

(4) N-乙酰-D-鞘氨醇（C2-神经酰胺）：I 类PI3K 通路抑制剂

(5)雷帕霉素：mTOR抑制剂

(6) Xestospongin B/C：IP3R 阻断剂

:3、自噬抑制剂

(1) 3-甲基腺嘌呤(3-MA)：（III 类PI3K）hVps34 抑制剂

(2)巴弗洛霉素A1：质子泵抑制剂

（3）羟氯喹（羟氯喹）：溶酶体腔碱化剂（溶酶体腔碱化剂）

衣霉素（来自Slreptomyces sp.TM 的衣霉素）。 Sigma-Aldrich公司产品，产品编号：T7765；溶解于DMSO制成储存液，使用时DMSO的最终体积浓度不应超过1/1000。

3-甲基腺嘌呤（3-甲基腺嘌呤，3-MA）。 Sigma-Aldrich公司产品，产品编号：M9281；溶解于灭菌超纯水中，制成储存液。

二磷酸氯喹盐(CQ)sigma-Aldrich公司产品，货号：C6628；溶解于无菌超纯水中，制成储备液。

雷帕霉素(rapamycin)，2.5mg/ml的DMSO溶液，Sigma-Aldrich公司产品，产品号：R8781；

：4、MDC染色荧光显微镜检测细胞常眠

Monodansylcadaverine (Monodansylcadaverine, MDC) 是一种荧光染料，用作自噬囊泡的示踪剂。具体操作步骤如下：

(1)按常规方法消化对数生长期的HepG2细胞，接种于6孔板中，每孔接种1x106个细胞；

(2) 当细胞密度达到60%-70%时，弃去培养基，用PBS仔细清洗一次，使用含有TG浓度0、0.5、1 nM和雷帕霉素（终浓度1 nM）的培养基） 分别。 pM)培养基24小时；

(3)弃上清，PBS洗两次，每孔加入MDC(终浓度50 nM)，在37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光孵育20 min；

(4)取出六孔板置于光学显微镜下，观察1 h内细胞自唾液的发生情况并拍照。

：5、流式细胞仪检测自噬发生情况

(1)取对数生长期的HepG2细胞，接种于6孔板，培养24小时后，用含有TG浓度为0的培养基继续培养，1、2、010- 24 小时内分别为630258 uM 和0.5 M。作用于TG不同时间（0、2：4、3：6、4：8、60h）后，取出六孔板，收集上清液至4ml离心管中；

(2)每孔加入2ml含MDC的MEM培养基(终浓度50nM)，恒温培养箱中37、5%0避光孵育30分钟；

(3)收集上清液，2000rpm离心5min；

(4)弃上清，向每管中加入500ul含MDC的MEM培养基（终浓度50uM），移液混合，37避光孵育30分钟；

(5)取出六孔板，用PBS洗涤两次，用0.25%胰蛋白酶消化2分钟，移取1ml PBS至1.5ml离心管中混匀，2000rpm离心5分钟；

(6)弃上清，加入1ml PBS重悬，2000rpm离心5min；

(7)吸出800ul上清液，剩余200ul移液混匀；

(8)将新鲜培养的上清液2000rpm离心5min；

(9)弃上清，收集1ml PBS至1.5ml离心管中，2000rpm离心5分钟；

(10)重复步骤(6)和(7)；

(11)将上述两管以相同浓度或相同时间点混合，过300目铜网进行计算机检测。流式细胞仪

使用488nm激发波长测量MDC染色的荧光强度。

条件为15% SDS-PAGE，正常跑胶至0.5cm下缘，200mA湿转45min，普通0.45 PVDF，5%牛奶封闭1h，4摇匀过夜，洗涤抗体3次*5分钟

LC3B Western-blot检测，配置15%分离胶，湿转250mA，60min

转自科研人员基金知识公众号##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用

以上就是关于雷帕霉素的作用机理的知识，后面我们会继续为大家整理关于雷帕霉素自噬诱导剂的知识，希望能够帮助到大家！