用鼠尾草和茶叶的混合液能染发吗？ 鼠尾裂解液蛋白酶k

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一、用鼠尾草和茶叶的混合液能染发吗？

二、剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立

一、用鼠尾草和茶叶的混合液能染发吗？

红茶可以染发。根据你的头发数量冲泡一些浓红茶。虽然可以反复使用，但每次用新鲜红茶冲洗并不困难。将头发放入容器中，然后用茶混合物冲洗头发。确保所有头发都被混合物弄湿。重复此过程15-20 次，根据需要添加新鲜茶叶。让最后的冲洗液在头发上停留15 分钟。用温水彻底冲洗红茶。每周重复一次以获得最佳效果。如果您想提高红茶的功效，可以添加指甲花使头发变黑。要注意的是，与衣服和皮肤接触时间过长会导致红茶染色，所以用它染发时最好戴上手套。此外，红茶会使头发稍微变黑，所以不要指望一夜之间发生巨大的变化。

二、剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立

[摘要] 目的建立保护骨素（OPG）基因敲除小鼠杂合胚胎干细胞模型，为建立基因敲除动物模型用于抗骨质疏松药物的研发奠定基础。方法PCR扩增两条同源臂，将两条同源重组片段插入XpPNT载体，构建OPG基因敲除打靶载体。线性化纯化后，电穿孔转导小鼠胚胎干细胞，使用G418和更昔洛韦进行双药筛选培养，获得双药耐药克隆，提取基因组DNA，采用PCR和southern杂交方法确定同源重组胚胎干细胞克隆。结果通过双药筛选获得124个双药克隆，经PCR和Southern杂交鉴定，获得同源重组胚胎干细胞克隆1个。结论总之，本研究成功获得OPG（-/+）杂合小鼠胚胎干细胞克隆，为进一步通过显微注射和交配育种获得OPG基因敲除小鼠，并研究OPG基因在体内的功能奠定了基础。这也使得建立基因敲除动物模型以开发抗骨质疏松药物成为可能。 [关键词] 基因敲除；胚胎干细胞；骨保护素；上海交通大学附属骨质疏松医院，上海200232 [摘要] 目的获得OPG基因敲除的同源重组胚胎干细胞(ES细胞)。方法通过PCR得到两条同源臂，以3.3kb Xbal/BamHI片段为短臂，3.9kb NotI/SalI片段为长臂，构建指向OPG外显子2和内含子2一小部分的打靶载体。纯化的靶向载体DNA 通过电穿孔转染至ES 细胞中，其中一些ES 细胞系在G418 和更昔洛韦选择中存活下来。通过PCR和Southern印迹扩增并鉴定双药耐药克隆。结果共收获双耐药克隆124个，其中1个阳性。结论本实验结果为进一步建立OPG基因敲除小鼠模型和深入研究OPG体内作用奠定了基础。 [关键词] 淘汰赛； ES细胞；骨保护素；骨质疏松症是一种以骨质脆性增加、易发生骨折为特征的全身性疾病，也是影响人类健康的常见病。如何建立特定的动物模型是相关领域的热点。骨保护素(osteoprotegerin, OPG)是近年来发现的一种具有抑制破骨细胞分化和吸收活性的分泌型糖蛋白[1],属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis Factor Receptor, TNFR)超家族。研究表明，OPG在骨质疏松症、类风湿性关节炎、佩吉特氏病和恶性骨组织疾病（骨肉瘤、巨细胞瘤、转移癌）的发病、防治中发挥着重要作用。本研究采用分子克隆方法设计构建小鼠OPG基因第二外显子大部分和第二内含子部分的打靶载体，并利用基因打靶技术删除小鼠ES OPG基因细胞。为显微注射制备OPG基因敲除小鼠模型奠定了基础。 1 材料与方法1.1 实验材料载体质粒pBluescript(+/-)和XpPNT质粒由上海南方模式生物中心提供，PCR产物克隆载体pGEMTeasy为Promega公司产品。

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、随机引物DNA标记试剂盒、各种Taq酶、PCR相关试剂和RT-PCR试剂盒均购自Takara和NEB公司。 DNAmarker（100bp 梯子、1kb 梯子、Lamda-HindIII 片段）购自NEB 和Takara。蛋白酶K购自上海生工生物工程技术服务公司。 Trizol 购自GibcoBRL 和Invitrogen。质粒微量提取试剂盒购自华顺生物工程公司和上海三工。质粒提取试剂盒和凝胶提取试剂盒（快速凝胶提取试剂盒）购自Qiagen。杂交液ExpressHyb 杂交液购自Clontech 公司。常规化学试剂主要购自Sigma和国药集团上海化学试剂公司。放射性同位素[-32P]-dCTP和[-32P]-dATP是Amersham公司的产品。细胞培养相关试剂：包括DMEM液体培养基（高糖、L-谷氨酰胺、无丙酮酸钠、ES细胞合格）、非必需氨基酸、谷氨酰胺、不含Ca2+/Mg2+的PBS、含Ca2+/Mg2+的PBS、 -巯基乙醇（2-mercaptoethanol）、胎牛血清（ES细胞合格）、G418、更昔洛韦（GANC）、二甲亚砜（DMSO）、青霉素/链霉素、胰蛋白酶（胰蛋白酶/EDTA）、胶原蛋白（明胶）等试剂均为GibcoBRL和Sigma公司产品，LIF（ESGROTM）为CHEMICON（澳大利亚）公司产品。用于细胞培养的35毫米和100毫米细胞培养皿，24孔、48孔和96孔细胞培养板、离心管等耗材均为康宁产品。引物合成及测序：由上海神友生物技术公司完成。根据序列数据，利用DNAstar软件包设计引物序列。 ES细胞系：小鼠体外传代至第13代，CJ7细胞系（来自Sv129小鼠）由上海第二医科大学基础医学院医学遗传学教研室保存。 1.2 实验方法1.2.1 打靶载体的构建1.2.1.1 ES细胞基因组DNA的提取收获状态良好的ES细胞，加入适量裂解液和蛋白酶K，56过夜；次日将样品室温12000rpm离心10min；用无水乙醇沉淀上清液，用冰上预冷的70%乙醇洗涤；干燥后，溶于适量纯水，4保存备用。 1.2.1.2 PCR方法获得两条同源臂将小鼠OPG基因cDNA序列在Genebank中进行比对（BLAST），获得小鼠OPG基因序列。根据NCBI GenBank提供的序列，使用DNAstar软件的Primerselect确定上下同源臂两对引物，上同源臂上游引物：CGTAGGATCCGTACCTCAGCCCTCTGAAGAT（对应OPG基因14842-14861bp）；下游引物：TCGGTCTAGACAGGAGCTAG AAGAGACACA（对应OPG基因18152-18171bp）； PCR条件：95，5分钟； 94，50秒； 60，50秒； 72，3.5分钟。 35个循环：72，10分钟； 4，永远。上游同源臂长3331 bp。下游同源臂上游引物：ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT（对应OPG基因18580~18598bp）下游引物：GTGGCGGCCGCACAGCCAGGACTGTCAACA（对应OPG基因22478~22497bp）； PCR条件为：95，5min； 94，50秒； 61.5，50秒； 72，4分钟。 35个循环：72，10分钟； 4，永远。下游同源臂长3918 bp。 1.2.1.3 将DNA片段正确克隆到XpPNT载体中。回收两个同源臂的PCR产物，连接至PCR产物克隆载体pGEMTeasy，大肠杆菌转化扩增后进行测序鉴定。常规方法是用NotI/SalI将下游同源臂引入到载体XPpnt中，然后用Xbal/BamHI将上游同源臂插入到已经含有上游同源臂的XPpnt载体中。酶切鉴定和序列测定表明连接序列正确。靶向载体被命名为5-3opg-XpPNT，用NotI 酶消化线性化，回收并储存在-20C 下以备将来使用。

1.2.2 ES细胞基因打靶1.2.2.1 ES细胞电穿孔基因转移取0.8 ml密度约为1.2107/ml的ES单细胞悬液，加入0.1 ml含Ca2+和Mg2+的PBS（含约30 g NotI Linearized） 5-3opgXpPNT)，混匀后转移至无菌电穿孔杯中。常温条件下，240 V、500 F电参数单脉冲触发后，重悬于ES培养基中，取细胞悬液均匀接种于两块胶原化35 mm平板中，用非选择性培养基回收进行药物筛选24 h 稍后。 1.2.2.2 耐药细胞的药物选择细胞电穿孔和基因转移后24小时开始药物选择。其中一块30 mm 板用于在含有选择性药物G418（终浓度：400 g/ml）和更昔洛韦（终浓度：2 mmol/L）的培养基中进行选择性细胞培养，另一块板仍用于非培养。 -选择性细胞培养。培养基作为对照。经过7-8天的筛选，ES细胞克隆长成肉眼可见的细胞集落，即可进行挑取。 14天内共挑取124个耐药细胞克隆。

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