免疫检测方法 罗丹明标记是什么颜色

网上有很多关于免疫检测方法的问题，也有很多人解答有关罗丹明标记是什么颜色的知识，今天每日小编为大家整理了关于这方面的知识，让我们一起来看下吧!

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一、双标记荧光免疫法中，如用四乙基罗丹明和异硫氰酸荧光素分别标记抗体，将呈现荧光的颜色是

二、免疫检测方法

一、双标记荧光免疫法中，如用四乙基罗丹明和异硫氰酸荧光素分别标记抗体，将呈现荧光的颜色是

正确答案：B解析：四乙基罗丹明(RB200)为橙色粉末，不溶于水，溶于酒精和丙酮。最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595 ~ 600 nm，呈橙色荧光。异硫氰酸荧光素(FITC)是黄色或橙色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。最大吸收波长为490 ~ 495 nm，最大发射波长为520 ~ 530 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。这个问题的正确答案是B.

二、免疫检测方法

免疫分析方法全集2017

免疫学检测技术应用广泛，可用于免疫性疾病的诊断、疗效评价和发病机理研究。比如传染病、免疫增生性疾病、免疫缺陷性疾病、超敏反应、自身免疫性疾病、移植排斥肿瘤的免疫学检测，对诊断和治疗有很大帮助。

此外，在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性和定量检查，不仅促进了各种免疫学现象的研究，而且扩展了免疫学与医学生物学许多领域的关系。本章仅介绍常用免疫学检测方法的原理、简要过程和实际意义。下面是我给大家带来的关于免疫学检测的知识。欢迎阅读。

第一节抗原或抗体的检测一、检测原理是利用抗原和抗体在体外特异性结合后出现的各种现象，对样本中的抗原或抗体进行定性、定量和局部的检测。

1.抗原与抗体的亲和力抗原与抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合不是化学反应，而是一种非共价的可逆结合。抗原决定簇和抗体可变区的互补构型导致两种分子之间的强亲和力。抗原和抗体分子之间的结合力随着空间构型互补程度的不同而不同。互补性越高，亲和力越强。

此外，反应温度、pH和离子浓度对抗原和抗体分子上基因的解离和电荷特性也有重要影响，抗体与抗原决定簇的结合力可以用亲和力来表示。亲和力高的抗体与抗原结合力强，即使在抗原浓度很低的情况下，也有更多的抗体与抗原结合形成免疫复合物。

2.抗原或抗体的体外检测原理根据抗原和抗体结合形成的免疫复合物的特性和活性，对样品中的抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。定性和定位检测相对简单，即将已知抗体与待测样品混合。一段时间后，如果出现免疫复合物形成的现象，说明待测样品中存在相应的抗原。如果没有预期的现象，说明样本中没有相应的抗原。

同样，已知的抗原也可以用来检测样本中是否有相应的抗体。

当定量检测抗原或抗体时，反应中加入的抗原和抗体的浓度是免疫复合物浓度的函数。

(1)根据产生的免疫复合物的量计算样品中抗原(或抗体)的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体(或抗原)的浓度不变，反应产生的免疫复合物的量与待测样品中所含相应抗原(或抗体)的量成正比。即抗体浓度不变时，免疫复合物越多，样品中的抗原越多。样品中抗原(或抗体)的含量可以通过实验标准曲线计算出来。

如免疫扩散试验、免疫比浊试验、酶联免疫吸附试验等。都属于这种方法。

(2)抗原或抗体的效价滴定原理：当抗原抗体复合物的量不能反映抗原抗体反应的强度时，通过检测反应的强度无法对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，低浓度反应成分(抗原或抗体)的浓度是固定的，而另一种高浓度反应成分被系列稀释。

比如用人血清作为抗原免疫三只兔子，比较三只兔子的抗体效价，可以用双向琼脂扩散法滴定。如固定抗体浓度，不同程度稀释抗原，将抗原或抗体分别滴入琼脂的相应孔中，观察到不同稀释度的免疫兔血清的抗原稀释度明显较浅(如兔A的抗体效价为1/2000，而兔C为1/800)

也就是说，效价稀释度越高，样品中待测成分越多。因为人血清(抗原)的浓度高于抗体(免疫兔血清)，所以要稀释抗原。

抗原或抗体检测的实际意义。抗体检测的意义抗体可以作为评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时，也需要进行纯度分析和定量测定。检测患者体内针对病原体、过敏原、HLA抗原、血型抗体以及各种自身抗体的抗体，对相关疾病的诊断具有重要意义。2.抗原检测的意义可用作检测抗原的物质可分为以下四类：

(1)各种微生物及其高分子产物：用于传染病的诊断、微生物的分类和鉴定、疫苗和疫苗的研究。(2)生物体内的各种大分子物质，包括各种血清蛋白(如各种免疫球蛋白和补体的各种成分)、可溶性血型物质、多肽激素、细胞因子和癌胚抗原等，均可作为抗原进行检测。这对研究这些成分的生物学功能和各种疾病的诊断具有重要意义。

(3)人和动物细胞的表面分子：包括各种分化抗原(如CD抗原)、同种异型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相关抗原和肿瘤相关气质抗原。这些抗原的检测对于研究各种细胞的分类、分化和功能，以及各种免疫相关疾病的诊断和发病机理具有重要意义。

(4)各种半抗原：一些药物、激素、炎症介质等。是小分子半抗原，可以分别偶联到大分子载体上，形成人工结合的完全抗原。用它免疫动物，制备各种半抗原抗体，应用于各种半抗原物质的检测，如监测部分患者服药后血液中的药物浓度。运动员服用违禁药物的检测都是基于半抗原检测。

三、抗原或抗体的检测方法由于各种检测方法所用抗原的特性不同，结果的现象也不同。应用最广泛的方法有：(1)可溶性抗原和抗体在沉淀反应中结合，当二者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。反应体系中出现不透明的沉淀，这种抗原抗体反应称为沉淀反应。

1.环状沉淀试验先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验(ring precipitationtest),此法简便易行，需用材料较多是其缺点。

2.单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验(single immunodiffusion)是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。

当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度(最低浓度)约为1020g/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需12天才能看结果

3.免疫比浊法当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法(immunonephelomytry)就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计(nephelometry)测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。

本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。

4，双向免疫扩散试验双免疫扩散试验(double immunodiffusion)是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现23条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。

5.对流免疫电泳对流电泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。

将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。

6.免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法分成两个步骤，即先进行电泳，再进行琼脂扩散。先将样品加入琼脂中电泳，将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双向免疫扩散，可形成多答卷沉淀线。常用此法进行血清的蛋白种类分析。

对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义

7.免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting)又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。第一步，为电泳分离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。第二步，将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上(电印迹)，然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。

如果病人血清中含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反应，最后加入显色底物(如果抗人Ig是用酶标记的)或做放射自显影(抗人Ig用125标记)以显示结果

第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离；

第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上；

第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上；

第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上；

第五步：加入显色底物(或放射自显影)显现第二抗体

(二)凝集反应

细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应(agglutination)。

1.直接凝集直接凝集(direct agglutination)是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断如肥达氏反应(Widal reaction)诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。

2.间接凝集间接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。如用球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。

也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒，一旦与含有相应抗原的脑脊液混合，便可发生凝集，可进行快速诊断。故凝集反应即可测定抗原，也可测抗体，方法简便、敏感。

3.抗球蛋白试验抗球蛋白试验(antiglobulin test,coombs test)的原理为间接凝集试验。例如应用于诊断自身免疫溶血性贫血症时，Rh+红细胞与抗Rh血清间的反应。因抗Rh抗体是IgG只有两个结合价，分子较小(不如IgM结合价多，分子大)很难直接引起Rh+红细胞凝集。如果加入抗IgG的抗体，就可帮助抗Rh的IgG的抗体凝集红细胞。也就是经抗Ig的作用提高凝集反应的'灵敏度。

(三)补体参与抗原抗体反应

这一类反应主要包括溶血反应(hemolytic assay)、补体介导的细胞毒试验(complement mediated cytotoxicuty test)及补体结合试验(complement fixation test)。

1.溶血反应抗体与红细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反应中的补体活化，导致红细胞溶解，此方法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测，此法比凝集反应敏感。溶血反应也是用于抗体分泌细胞即空斑形成细胞(PFC)检测的原理。

2.补体介导的细胞毒试验各种有核细胞与针对其表面抗原的抗体相遇，所形成的免疫复合物能活化反应中的补体，引起细胞膜穿孔，在一定时间内，细胞仍能维持一定的形态不破碎，加入水溶性染如伊红Y(eosin Y)或台盼蓝(trypan blue)后，染料即可进入被活化补体穿孔的细胞，不带相应抗原细胞膜保持完整的活细胞不着色。

此方法可用于带各种抗原的细胞的检测，如进行细胞MHC抗原的鉴定，和进行淋巴细胞中T细胞总数或其亚类的计数。在一些免疫学实验中也可用这种方法，根据需要特异地消除带某种抗原的细胞。

3.补体结合试验当抗原(可溶性或颗粒性)与相应抗体结合，由于浓度低不出现可见反应时，应用补体结合试验可检出此抗原抗体反应，它比凝集反应或沉淀反应灵敏度高。本法包括两个抗原抗体系统。一为检测系统由待检样品与已知抗原(或抗体)组成；另一为指示系统，由绵羊红细胞(SRBC)和抗SRBC组成。另加入作为补体的新鲜豚鼠血清。

试验时试管中先加入检测系统和补体，混合经3730分钟使抗原、抗体、补体形成复合物，再加入指示系统，如出现溶血现象，说明检测系统中没有相对应的抗原抗体，补体是游离的指示系统的SRBC和抗体结合而出现溶血，即为反应阴性。如不出现溶血，表明检测系统中有抗原抗体复合物并结合补体，则指示系统无多余的补体作用而没有溶血现象，即为阳性。

在敏感的抗原、抗体检测方法(如酶标方法)出现之前补体结合试验曾广泛用于检测各种细菌、病毒或螺旋体(如梅毒)的抗原或抗体，由于本试验影响因素多，结果不稳定现已被新检测方法所代替。

四、用标记抗体或抗原进行的抗原、抗体反应

用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。

1.免疫荧光技术免疫荧光技术(immunofluorescence techni)是用化学方法使荧光素标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的相应抗原(或抗体)结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。

(1)直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞(如T细胞和B细胞)或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。

本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。

(2)间接荧光法：可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体(不标记荧光)结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法相同。

间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体

免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外，还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。

针对细胞表面不同抗原，可以使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素(FITC)发黄绿荧光，用罗丹明(TMRITC)发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。

2.放射免疫分析法放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法常用的同位素有125和131。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：

(1)液相法：将待检标本(例如含胰岛素抗原)与定时的同位素标记的胰岛素(抗原)和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战性与胰岛素抗体结合。非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物越少。

非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量

(2)固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰(CNBr)海豹化的纸片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法应用范围广泛，包括多种激素(胰岛素、生长激素、甲状腺素等)维生素、药物、IgE等。

3.酶联免疫分析法酶联免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酶(alkaline phosphatase)等。

它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者主要测定可溶性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，所以较放射免疫分析法更易推广。

(1)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是与上述固相RIA相似的原理，将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行政区。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。

(2)夹心法(sandwich assay):将已知的特异抗体包装在固相载体(塑料板凹孔或纸片上)，加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。

间接法(indirecr ELISA)常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本(可能含有相应抗体)，再加入酶标抗Ig的抗全(即第二抗体)，经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。

(3)BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素(avidin)分子可以结合4个生物素分子(biotin)。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。

一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

以上就是关于免疫检测方法的知识，后面我们会继续为大家整理关于罗丹明标记是什么颜色的知识，希望能够帮助到大家！