请教流式细胞的具体实验步骤 流式细胞术实验步骤

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一、请教流式细胞的具体实验步骤

一、请教流式细胞的具体实验步骤

一、细胞表面标志物1的检测。试剂被平衡到室温。准备：台面消毒；穿好工作服、帽子、口罩、手套，放好棉签、卫生纸和有盖垃圾桶(装满消毒液)。2.写有编号的纸并标上号码。1-IgG 1/IgG 1/IgG 12-CD4/CD8/CD33-cd14/cd454-3。每管加入10l/相应抗体/每种和50l全血，摇匀，室温避光20分钟。在添加血液之前，充分摇匀血液样本。4.加入1ml溶血素，摇匀，室温避光10分钟。5.以1200 rpm的速度离心5分钟。弃去上清液并摇匀。

6.加入2ml PBS洗液，摇动并以1200 rpm离心5分钟。弃去上清液并摇匀。7.加PBS 900l l，上电脑前保存4度。8.上飞机。二、细胞内细胞因子的检测1。准备：台面消毒；穿好工作服、帽子、口罩、手套，放好棉签、卫生纸和有盖垃圾桶(装满消毒液)。2.写有编号的纸并标上号码。

IgG 1/CD8/cd3 IFN-；/CD8/CD33。(3-5在超净台中操作)取出PMA(1100)、BFA(110)和离子霉素(110)，用无菌无叠氮化钠PBS稀释储存液。4.刺激：取50L/管全血或PBMCs(细胞数为0.5-1 106)，然后加入50l RPMI1640稀释2倍，加入刺激因子PMA、离子霉素、BFA，混匀。全血中的最终浓度：PMA:50ng/ml离子霉素：1g/ml BFA: 10g/ml。5.37，5% CO2，4小时孵育(最好用盖子宽松的培养箱)。

6.细胞外染色：每管加入20l相应的表面抗体和100l活化全血，混匀，室温避光20分钟。7.溶血：每管加入2ml溶血素，室温避光10分钟。离心机，1200转/分，5分钟。丢弃上清液。8.破膜透过率：每管加入0.5ml渗透剂，室温下避光10分钟。加入2mlPBS，以1000 rpm旋转，离心5分钟。丢弃上清液。9.细胞内染色：加入IFN-；或IgG1-1抗体20l，混匀，室温避光30分钟。加入2ml PBS，以1000 rpm旋转，离心5分钟，弃去上清液。10.加入PBS 500l l。

上电脑前先存4度。11.计算机测试。注：本实验室可以提供流式细胞仪服务或流式细胞仪，不会做的新手可以去自己家里观察。这个实验室是正规三甲医院的科研共享平台，所有开放的实验都是这个实验最常规的技术服务。除了流式细胞术，还有荧光定量pcr，芯片免疫沉淀，Westerbblot，细胞培养，细胞系暂时开放。

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