凝胶渗透柱层析 聚丙烯酰胺凝胶柱

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一、凝胶渗透柱层析

一、凝胶渗透柱层析

简介凝胶色谱又称凝胶排阻色谱、分子筛色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱等，是一种以多孔凝胶填料为固定相，按分子顺序分离样品中各种组分的液相色谱方法。尺寸。 1959年，Porath和Flodin首先采用多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。 1964年Moore制备了不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够在有机溶剂中分离，称为凝胶渗透色谱（流动相为有机溶剂的凝胶色谱一般称为凝胶渗透色谱）。色谱法）。随后，这项技术不断完善和发展，目前广泛应用于生物化学、高分子化学等多个领域。凝胶色谱是生物化学中常用的分离方法。具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好，特别是不改变样品的生物活性等优点。因此广泛应用于蛋白质（包括酶等生物分子的分离纯化）、核酸、多糖等领域。还用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓度等。 凝胶色谱的基本原理凝胶色谱是根据分子大小的物理性质进行分离和纯化。色谱流程如图2-23所示。凝胶色谱的固定相是惰性珠状凝胶颗粒。凝胶颗粒内部具有三维网络结构，形成许多孔洞。当含有不同分子大小组分的样品进入凝胶色谱柱时，每种组分扩散到固定相的孔中。组分的扩散程度取决于孔的大小和组分分子的大小。大于孔径的分子不能扩散到孔内，被完全排除在孔外。它们只能与凝胶颗粒外部空间中的流动相一起向下流动。流程短，流动快，所以先流出；而较小的分子可以完全渗透到凝胶颗粒的内部，过程较长，流动速度较慢，所以最终会流出；而分子大小介于两者之间的分子则在流动过程中部分渗透，渗透的程度取决于它们。由于分子的大小，所以它们的流出时间介于两者之间。分子较大的成分先流出，分子较小的成分后流出。这样，样品经过凝胶色谱后，各组分按照从大分子到小分子的顺序流出，从而达到分离的目的。凝胶的类型和性质凝胶有多种类型。常用的凝胶有葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖。之间有交叉链接。还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等，下面分别介绍。 (1)葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶是指天然高分子葡聚糖与其他交联剂交联而成的凝胶。右旋糖酐凝胶主要由法玛西亚生物技术公司生产。常见的有两类，商品名为Sephadex和Sephacryl。最常见的葡聚糖凝胶是Sephadex系列，它是葡聚糖和3-氯-1,2-环氧丙烷（交联剂）交联而成。交联度由环氧氯丙烷的百分比决定。控制。 Sephadex的主要型号有G-10G-200。下面的数字是凝胶的吸水率（单位为mL/g干胶）乘以10。例如Sephadex G-50表示吸水率为5mL/g干胶。 Sephadex 非常亲水，在水中很容易溶胀。不同型号的Sephadex具有不同的吸水率，其孔径和分离范围也不同。数字越大，排除限度越大，分离范围越宽。 G-200是Sephadex中排除限度最大的，为8105。

Sephadex在水溶液、盐溶液、碱性溶液、弱酸溶液和有机溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。 Sephadex稳定工作的pH值一般在210之间。强酸性溶液和氧化剂会水解并破坏交联糖苷键，因此应避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。 Sephadex 在高温下稳定，可煮沸灭菌。 100、40分钟对凝胶的结构和性能无明显影响。 Sephadex 呈弱酸性，因为它含有羟基，这使得它可以吸附分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白质）。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附。因此，在使用Sephadex进行凝胶层析实验时，常采用一定浓度的盐溶液作为洗脱液。这样可以避免Sephadex和蛋白质的吸附。但需要注意的是，如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积的变化。大变化。 Sephadex有多种粒径（一般为粗、中、细、超细）可供选择。一般粗颗粒流速快，但分辨率差；细颗粒的流速较慢，但分辨率较高。应根据分离要求选择粒度。 Sephadex的机械稳定性较差，不耐压，高分辨率的细颗粒需要较慢的流速，因此无法实现快速高效的分离。另外，在Sephadex G-25和G-50上分别添加羟丙基，反应形成LH型烷基化葡聚糖凝胶。主要型号有Sephadex LH-20和LH-60，适合与有机溶剂一起使用。用于分离脂溶性物质如胆固醇、脂肪酸激素等的流动相。Sephacryl是葡聚糖和亚甲基双丙烯酰胺（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）之间的交联。它是一种相对新型的葡聚糖凝胶。 Sephacryl的优点是分离范围大，排除限甚至可以达到108，比Sephadex的范围大很多。因此，它不仅可以用于分离一般蛋白质，还可以用于分离蛋白聚糖、质粒，甚至更大的病毒颗粒。 Sephacryl与Sephadex相比的另一个优点是其更高的化学和机械稳定性：Sephacryl在各种溶剂中很少溶解或降解，可以与各种去垢剂、胍、尿素等一起用作洗脱液，并且耐高温， Sephacryl稳定工作的pH值一般为3~11。此外，Sephacryl具有更好的机械性能，可以在更高的流速下洗脱，更耐压，并且具有更高的分辨率。因此，与Sephadex 相比，Sephacryl 可以实现相对快速、分辨率更高的分离。 (2)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺交联而成。通过改变丙烯酰胺的浓度，可以获得不同交联度的产品。聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad实验室生产。商品名为Bio-Gel P。主要型号有Bio-Gel P-2Bio-Gel P-300等10种类型。下面的数字基本代表了他们的排除。极限为103，因此数字越大，可分离的分子量越大。各型号主要参数见附表。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能与Sephadex基本相似。 Bio-Gel P-300 的最大排除限为4105。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中稳定性良好，在pH 110之间比较稳定。但在强碱性条件或高温下，聚丙烯酰胺凝胶容易分解。聚丙烯酰胺凝胶亲水性很强，且基本不带电荷，因此吸附作用较小。此外，聚丙烯酰胺凝胶不像葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样具有生长微生物的潜力。

聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能有轻微的吸附作用，使用离子强度稍高的洗脱液可以避免这种现象。 (3)琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖。它是通过从琼脂中除去带电的琼脂糖凝胶而获得的。琼脂糖是由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖交替组成的多糖链。 100C 时为液体。当温度降至45以下时，多糖链通过氢键相互连接，形成双链单环琼脂糖，凝结成束状琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因制造商而异。常见的有Pharmacia Biotech生产的Sepharose（2B~4B）和Bio-Rad Laboratories生产的Bio-gel A。琼脂糖凝胶在pH 49之间稳定，在室温下非常稳定，其稳定性高于普通右旋糖酐凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外，琼脂糖凝胶的机械强度和孔稳定性都很好，一般优于前两种凝胶。在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生显着变化。使用琼脂糖凝胶时，洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排除限很大，分离范围很宽。适用于大分子物质的分离，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，适宜的操作温度为0-30。 Sepharose 与2,3 二溴丙醇反应形成Sepharose CL 型凝胶（CL-2B ~ CL-4B）。它们的分离特性基本不变，但热稳定性和化学稳定性有所提高，并且可以在更广泛的pH范围内使用，稳定的工作pH范围为3-13。 Sepharose CL 型凝胶还特别适用于含有有机溶剂的分离。 (4) 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶这种凝胶是由交联聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内的琼脂糖组成。它们主要由LKB 以商品名Ultragel 提供。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺而具有更高的分辨率；它还含有琼脂糖，这使其具有更高的机械稳定性并允许更高的洗脱率。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel具有不同的分离范围。 (5)多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶、多孔玻璃珠均为无机凝胶。顾名思义，它们是由硅胶或玻璃制成具有一定直径的网状结构的球形颗粒。这种凝胶是一种硬质无机凝胶。其最大特点是机械强度高、化学稳定性好、使用方便、寿命长。无机凝胶一般柱效较低，但其由颗粒状多孔硅胶制成。 HPLC柱还可以具有非常高的柱效，可以达到4104板/米。多孔玻璃珠容易破碎，不能紧密堆积，因此柱效较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围比较宽。多孔硅胶一般为102-5106，多孔玻璃珠一般为3103-9106。它们最大的缺点是吸附作用较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附较多的蛋白质，但可以通过表面处理和洗脱液的选择来减少吸附。另外，不能在强碱性溶液中使用，一般使用时pH值应小于8.5。另外值得一提的是，近年来各种凝胶技术发展迅速，开发出许多性能优越的新型凝胶。例如，法玛西亚生物技术公司的Superdex和Superrose。 Superdex具有非常高的分辨率和良好的化学和物理稳定性，可用于FPLC和HPLC分析； Superose分离范围广，分辨率高，可一次性分离分子量。差异很大的混合物。同时，它的机械稳定性也非常好。

有关各种凝胶产品的详细信息，请参阅本书的附录和各公司的产品目录。凝胶的选择、处理和保存(1)凝胶的选择从前面的介绍中可以看出，凝胶的种类和型号很多。不同类型的凝胶在性质和分离范围上有很大差异。因此，在进行凝胶色谱实验时，必须根据样品的性质和分离要求选择合适的凝胶。这会影响凝胶色谱的效果。好坏的关键因素。一般来说，选择凝胶时首先要根据样品情况确定合适的分离范围，然后根据分离范围选择合适的凝胶型号。一般的凝胶色谱实验可分为两类：成组分离和分级分离。群体分离是指将样品混合物根据分子量分为两组，一组分子量较大，另一组分子量较大。较小。例如，蛋白质样品的脱盐或去除蛋白质、核酸溶液中的小分子杂质，以及某些进样去除大分子热原物质等。分馏是指分离一组分子量比较接近的组分。进行群体分离时，应选择能完全排除大分子、完全渗透小分子的凝胶，这样分离效果好。一般来说，通常使用排除限较小的凝胶类型。分馏时，应根据样品组分的具体情况选择凝胶类型。凝胶的分离范围一方面应包括所需各组分的分子量，另一方面应适当，不能太大。如果分离范围选择太小，有些组分就无法分离；如果分离范围选择太大，则分辨率低，分离效果差。凝胶选择的另一个方面是凝胶颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成严重的扩散现象；颗粒大、流速快、分辨率低，但在适当的条件下可以获得满意的结果。应根据分居的具体情况进行选择。例如，如果样品中的各种成分差异较大，可以选择颗粒较大的凝胶，这样可以快速达到分离的目的；如果各个组分之间的差异很小，则考虑使用小颗粒凝胶来提高分辨率。由于凝胶一般比较稳定，在正常的实验条件下可以正常工作。如果实验条件比较特殊，如在强酸、强碱或含有有机溶剂等情况下进行，应仔细检查凝胶的工作参数，选择合适的凝胶类型。 (2) 凝胶处理凝胶在使用前必须先进行处理。选择凝胶类型后，首先要根据所选的色谱柱估算凝胶的量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常为无水干凝胶，因此必须计算干凝胶的用量：干凝胶用量（g）=柱床体积（mL）/凝胶床体积（mL）/g）。由于凝胶加工和实验过程中可能会有一定的损失，因此一般凝胶用量应根据计算增加10%-20%。右旋糖酐凝胶和丙烯酰胺凝胶干凝胶的加工首先是在水中膨胀。不同类型的凝胶需要不同的膨胀时间。一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排除限较小的凝胶）膨化时间较短，20时需要3-4小时；但吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻限较大的凝胶，则膨胀时间较长。20时需要十几到几十个小时。例如Sephadex以上的干凝胶的膨胀时间G-100为72小时以上。如果加热煮沸，膨化时间会大大缩短，一般在1-5小时内完成，煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但要注意避免加热酸或碱中以避免凝胶损坏。

琼脂糖凝胶和一些市售凝胶处于水悬浮状态，因此不需要膨胀。另外，多孔玻璃珠和多孔硅胶不需要膨胀。膨胀后，必须纯化凝胶并除去气泡。纯化包括反复冲洗和倾倒，以去除表面杂质和不均匀的细凝胶颗粒。也可以将其放在一定的酸或碱中浸泡一段时间，然后用水洗至呈中性。消除凝胶中的气泡非常重要，否则会影响分离效果。可以通过抽空气或加热煮沸的方法消除气泡。 (3)凝胶的保存凝胶的保存一般是反复洗涤除去蛋白质等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常为0.02%叠氮化钠，4保存。如果想保存更长时间，需要将凝胶清洗、脱水、干燥。可将凝胶过滤沥干，放入50%乙醇中浸泡脱水。沥干后，逐渐增加乙醇浓度，反复浸泡脱水，直至达到95%。 %乙醇并排干凝胶。将其放入60C 的烤箱中干燥，然后装瓶储存。注意膨化凝胶不能直接高温干燥，否则可能会破坏凝胶的结构。凝胶色谱的基本操作凝胶色谱的基本操作步骤与前面介绍的柱色谱的操作流程基本类似，这里不再赘述。下面主要介绍凝胶色谱操作时应注意的一些具体问题。 (1)层析柱的选择层析柱的规格主要根据样品的量和分辨率要求来选择。一般来说，色谱柱的长度对分离度影响较大。长色谱柱比短色谱柱具有更高的分辨率；但层析柱的长度不能太长，否则会造成柱子不均匀一、 存在流速太慢等实验困难。一般情况下，立柱的长度不超过100cm。为了获得高分辨率，可以串联使用色谱柱。色谱柱的直径与长度之比一般在1:25-1:100之间。用于组分离的凝胶柱，例如脱盐柱，由于分辨率要求较低，通常较短。 (2) 凝胶柱的鉴别凝胶柱的装填情况将直接影响分离效果。填充方法之前已经介绍过。这里主要介绍一下填充凝胶柱的鉴别。凝胶柱装满后，肉眼观察应均匀、无线条、无气泡。另外，通常可以使用有色物质，如蓝葡聚糖-2000、血红蛋白等上样柱，观察柱内有色区的洗脱行为，以检测凝胶柱的均匀性。如果色带窄、平坦、滴落均匀，说明柱内凝胶填充良好，可以使用；如果色带扩散或扭曲，则需要重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新的凝胶柱吸附样品，可以用一些物质提前过柱，以消除吸附。 (3)洗脱液的选择由于凝胶色谱的分离原理是分子筛作用，因此它不像其他色谱分离方法主要依靠溶剂强度和选择性的变化来进行分离。在凝胶色谱中，流动相仅起载体作用，一般不依赖流动相性质和组成的变化来提高分辨率。改变洗脱液的主要目的是消除组分与固定相之间的吸附等相互作用，因此与其他色谱方法不同。相比之下，凝胶色谱洗脱液的选择不太严格。由于凝胶色谱的分离机理简单，且凝胶稳定运行的pH范围较宽，因此洗脱液的选择主要取决于待分离的样品。一般来说，只要缓冲液能够溶解洗脱物质而不使其变性，液体就可以用于凝胶色谱。为了防止凝胶可能被吸附，洗脱液中一般含有一定浓度的盐。 (4)样品添加量前面已介绍过。它应该尽可能快且均匀。

另外，样品的添加量也可能对实验结果产生较大的影响。如果样品添加过多，洗脱峰会重叠，影响分离效果。如果样品添加太少，纯化后的组分就会少，浓度低，导致实验出现问题。效率低。样品的添加量取决于具体的实验要求：凝胶柱越大，样品量当然可以越大；样品中各组分的分子量差异较大，因此样品量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1%-5%，而分组分离时加样体积可较大，一般约为凝胶柱床体积的10%-25%。如果条件允许，可以先用较小的样品体积进行分析，根据洗脱峰选择合适的样品体积。假设待分离的两种组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，则上样体积不能超过(Ve1-Ve2)。事实上，由于样品扩散，样品体积应小于该值。从洗脱峰角度来看，如果各所需组分的洗脱峰分离较宽，为了提高效率，可以适当增加样品量；如果各组分的洗脱峰只是刚刚分离或未完全分离，则样品体积无法增加甚至减少。另外，加样前请注意，上样前必须除去样品中的不溶物，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能太高，否则会影响分离效果。 (5)洗脱速度洗脱速度也会影响凝胶色谱的分离效果。一般情况下，洗脱速度应恒定、适当。保持洗脱速率恒定的方法通常有两种，一种是采用恒流量泵，另一种是采用恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶类型、粒径等。一般来说，洗脱速度较慢的样品可以与凝胶基质充分平衡，达到良好的分离效果。但如果洗脱速度太慢，会加剧样品扩散，谱带变宽，从而降低分辨率，大大延长实验时间。因此，实验时应根据实际情况选择合适的洗脱速度。您可以通过选择洗脱速度来进行预备实验。一般情况下，凝胶的流速为2-10cm/hr。市售凝胶一般都会提供推荐流速以供参考。总之，凝胶色谱的各种条件，包括凝胶类型、色谱柱尺寸、洗脱液、上样量、洗脱速度等，必须根据具体的实验要求进行选择。例如，如果样品中组分之间的差异很小，则实验需要凝胶色谱具有更高的分辨率。提高分辨率的选择应主要包括：选择包含待分离各组分但分离范围较小的凝胶。选择小颗粒的凝胶，选择高分辨率的凝胶类型，选择更长更大直径的色谱柱，减少样品添加量，降低洗脱速度等。但正如前面提到的，各种选择都有一个限度。超过这个限制可能会产生相反的效果。另外需要提到的一点是，在实验过程中，应尽可能参考相关实验和文献，进行初步实验，选择最合适的实验条件。凝胶色谱的应用前面已经介绍了凝胶色谱的基本理论和基本实验操作。下面简单介绍一下凝胶色谱在生物学中的应用。 (1)凝胶色谱法纯化生物大分子是基于分子量的差异。凝胶层析由于其分离特点及其简单、方便、不改变样品生物活性等优点，已成为生物大分子分离纯化的重要方法，特别是对于大小不同但不影响样品的分子。物理化学性质相似，用其他方法很难分离，而凝胶色谱无疑是一种合适的方法。例如，不同聚合度聚合物的分离。

(2)分子量测定前面提到，在一定范围内，各组分的Kav和Ve与其分子量的对数呈线性关系。 Kav=-b lg MW+cVe=-b' lg MW+c' 这样，通过洗脱已知分子量的标准物质，绘制出Ve 或Kav 与分子量对数的标准曲线，然后得出在相同条件下测定未知物质的Ve。或者Kav，可以通过标准曲线计算出其分子量。凝胶色谱法测定分子量相对简单，需要少量样品。是初步测定蛋白质分子量的有效方法。该方法的缺点是测量结果的准确性受多种因素影响。由于该方法假设标准品和样品均不对凝胶有吸附作用，如果标准品或样品对凝胶有一定的吸附作用，则测量误差会比较大；上式成立的条件是蛋白质基本呈球形，但对于某些细长形蛋白质如纤维蛋白则不然，因此凝胶色谱不能用于测定此类分子的分子量；另外，由于糖的水合作用很强，因此采用凝胶色谱法来测定糖蛋白。测量时，测得的分子量偏大，而测量铁蛋白时，发现测得的值偏小；还需要注意的是，标准蛋白和被测蛋白都必须在凝胶色谱的线性范围内。 (3)脱盐去除小分子杂质利用凝胶色谱法脱盐去除小分子杂质是一种简单、有效、快速的方法。它比透析的一般脱盐方法要快得多，并且一般不会导致样品稀释度越大，生物分子变性的可能性就越小。一般使用的是SephadexG-25，也有排除限较小的凝胶类型如Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202。目前有多种成品脱盐柱出售，使用方便，但相对较贵。 4）致热物质致热物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物以及其他引起人体发热的物质。它们是一类分子量较大的物质，因此可以利用凝胶色谱的排阻作用将这些大分子热源物质与其他分子量相对较小的物质分离。例如，凝胶色谱法是去除某些注射液中的水、氨基酸和致热物质的简单而有效的方法。 (5)溶液的浓缩利用凝胶颗粒的吸水性可对大分子样品溶液进行浓缩。例如，如果在溶液中加入干燥的Sephadex（粗颗粒），Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透到凝胶孔中，而大分子物质则被排除在外。通过离心或过滤除去凝胶颗粒，得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本上不改变溶液的离子强度和pH值。

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