SDS-PAGE电泳求助专题 聚丙烯酰胺凝胶结构

网上有很多关于SDS-PAGE电泳求助专题的问题，也有很多人解答有关聚丙烯酰胺凝胶结构的知识，今天每日小编为大家整理了关于这方面的知识，让我们一起来看下吧!

内容导航：

一、SDS-PAGE电泳求助专题

一、SDS-PAGE电泳求助专题

SDS-PAGE电泳是实验室常用的实验。这里总结了关于SDS-PAGE电泳的一些有代表性的问题，供大家参考和指正。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量交联剂N,Nˊ-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和促进剂（N,N, NˊNˊ-四甲基乙二胺)，凝胶聚合交联成三维网络结构。使用这种凝胶作为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 PAGE按是否具有浓缩作用分为连续系统和间断系统两大类。以前的电泳系统中，缓冲液pH值和凝胶浓度相同，带电粒子在电场中的游动主要依靠电荷和分子筛效应；在后一种电泳系统中，缓冲液离子组成、凝胶浓度和电位梯度是不连续的。带电粒子在电场中的迁移主要取决于电荷和分子筛效应，还取决于浓度效应。 PAGE的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了蛋白质的分辨率。 SDS-PAGE电泳的基本原理。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将SDS（十二烷基硫酸钠）引入到聚丙烯酰胺凝胶体系中。 SDS可以破坏分子内和分子间氢键并破坏蛋白质。二级和三级结构，强还原剂可以破坏半胱氨酸之间的二硫键。在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，蛋白质与SDS分子按比例结合，形成带负电的分子。 SDS-蛋白质复合物，由于大量SDS的结合，使蛋白质失去原有的电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子簇，从而减少或消除了各种蛋白质分子之间的相互作用。由于天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合与重量成正比，因此电泳时蛋白质分子的迁移速度取决于分子的大小。当分子量在15KD~200KD之间时，蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，其中：MW为分子量，X为迁移率、k 和b 都是常数。如果将已知分子量的标准蛋白质的迁移率相对于分子量的对数作图，就可以获得标准曲线。将未知蛋白在相同条件下进行电泳，根据其电泳迁移率在标准曲线上计算出分子量。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高等优点。 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和小规模制备。它还可用于测定分子量和等电点。凝胶缓冲系统的配制SDS-PAGE不连续电泳中，凝胶配制缓冲液采用Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶pH 6.7，分离胶pH 8.9；电泳缓冲液采用Tris-Glycine缓冲系统。蛋白质在浓缩胶上浓缩成窄条带。当样品进入分离凝胶时，游动速率增加，直接跟随氯离子。同时，由于分离胶孔径的减小，在电场的作用下，蛋白质分子根据其固有电荷和分子大小而被分离。因此，pH对整个反应体系的影响至关重要。如果实验中排除其他因素后仍不能很好地解决问题，则应首先考虑该因素。丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体。其凝固质量直接关系到电泳的成功与否，与凝固剂及环境密切相关； TEMED和AP加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子洗涤剂，具有四种功能：去除蛋白质电荷、解离蛋白质间的氢键、取消蛋白质分子内的疏水相互作用、去除多肽折叠。

凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶根据凝胶配方和蛋白质分离需要进行制备。凝胶在室温下固化后，可在室温下放置一段时间后再使用。请勿立即使用或存放在4 摄氏度的冰箱中。前者容易导致混凝不充分，而后者则容易导致SDS结晶。一般凝胶室温可保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺的充分聚合可以提高凝胶分辨率。根据样品分离的目的，样品处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、烷基化还原SDS处理。 1、 还原SDS处理：在上样缓冲液中加入SDS和DTT（或-巯基乙醇）后，蛋白质构象解离，电荷中和，形成SDS与蛋白质结合的分子。电泳时，仅根据分子量进行分离。一般情况下，电泳都是这样进行的。将样品稀释至适当浓度，加入loading buffer，离心，沸水中煮5分钟，然后离心加入样品。 2、 烷基化还原SDS处理：碘乙酸胺烷基化可以很好、牢固地长时间保护SH基团，并获得较窄的谱带；另外，碘乙酸胺可以捕捉过量的DTT，防止银染时出现纹理现象。将10ul 20% 碘乙酸铵溶解于100ul 样品缓冲液中，室温孵育30 分钟。 3、 非还原性SDS处理：生理液、血清、尿素等样品一般在1%SDS沸水中煮3分钟，不添加还原剂，因此蛋白质折叠不被破坏，不能用于测定分子量。蛋白质染色电泳后，目前常用考马斯亮蓝法进行蛋白质染色。比氨基黑染色更灵敏，可以进行定量扫描，比银染更简单。常见问题及解决办法1：拖尾现象主要是样品熔化效果不好或分离胶浓度过高造成的。处理方法：加样前离心；选择合适的样品缓冲液并加入适量的样品增溶剂；如果电泳缓冲液时间太长，请重新配制；降低凝胶浓度。 2：“笑”字形带（两侧凸起，中间凹陷）主要是凝胶中部凝固不均匀造成的，常出现在较厚的凝胶中。处理方法：等待其完全凝固后再进行后续实验。图3：“皱眉”形条带（两侧中间向下凸出）主要出现在蛋白质垂直电泳槽中。一般两板之间底部间隙的气泡还没有完全消除。解决方法：在两板之间加入适量缓冲液，消除气泡。 4：电泳带很粗。电泳条带很粗是常见现象，主要是因为没有很好地集中。解决方法：适当增加浓缩胶的长度；确保浓缩胶储存液的pH 值正确（6.7）；适当降低电压； 5：“幽灵乐队”，如何应对？ “鬼带”是一些未知的大分子带，在运行具有复杂大分子构象的蛋白质分子时，常常出现在泳道顶部（有时在堆积胶中）或在采样孔底部沉淀。这主要是由于还原剂的加热造成的。在此过程中被氧化而失去活性，导致原本解离的蛋白质分子重新折叠结合、亚基重新缔合，聚合成分子量大于目标条带的大分子，有时无法进入分离胶。但它与目标条带具有相同的免疫活性，在WB反应中可以看出它可以充当与目标条带对应的抗体。处理方法：加热煮沸后，加入适量DTT或-巯基乙醇，补充还原剂不足；或添加适量的EDTA以防止还原剂氧化。 6：电泳电压很高，但电流很低。这种现象在初学者中很常见。例如，电压高于50v，但电流低于5mA。主要原因是电泳槽组装不正确，电流没有形成通路。

包括：a.内、外罐装反； b.外罐液体太少； C。电泳槽底部的绝缘体没有去除（如灌胶用的胶皮）。解决方法：正确组装电泳槽即可。 7：纹理现象主要是样品中不溶颗粒造成的。处理方法：加样前离心；添加适量的样品增溶剂。 8：溴酚蓝不能作为指示剂。在实验中，我们经常会遇到溴酚蓝已经跑出板底的现象，但蛋白质还没有跑下来。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。解决方法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 9：浓缩胶和分离胶破裂，板间有气泡。答：这主要发生在初学者中，一般对电泳没有太大影响。前者主要是拔梳子时用力不均匀或用力过大造成的；后者是由于松开胶夹后板材没有压紧而进入空气造成的。

以上就是关于SDS-PAGE电泳求助专题的知识，后面我们会继续为大家整理关于聚丙烯酰胺凝胶结构的知识，希望能够帮助到大家！